初榨橄欖油揮發(fā)性風(fēng)味成分的鑒定

鐘 誠(chéng) 薛雅琳 王興國(guó) 張 東 張東生 徐 冉

（江南大學(xué)食品學(xué)院1，無(wú)錫 214122）

（國(guó)家糧食局科學(xué)研究院2，北京 100037）

中國(guó)從1964年開(kāi)始引種油橄欖，經(jīng)過(guò)30年的引種試驗(yàn)，目前初步確定了我國(guó)油橄欖的三大適生區(qū)為白龍江低山河谷區(qū)、金沙江干熱河谷區(qū)和長(zhǎng)江三峽低山河谷區(qū)[1]。其中甘肅省隴南市武都區(qū)目前是全國(guó)最大的油橄欖生產(chǎn)基地，截止2012年底，隴南市油橄欖基地面積已達(dá)1.95萬(wàn)hm2，掛果面積6 700公頃，年產(chǎn)鮮果7 600 t，年產(chǎn)油1 140 t。國(guó)內(nèi)油橄欖種植產(chǎn)業(yè)的飛速發(fā)展帶動(dòng)了國(guó)產(chǎn)初榨橄欖油生產(chǎn)加工和消費(fèi)需求，也使得初榨橄欖油豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和獨(dú)特的感官風(fēng)味備受青睞。初榨橄欖油是從新鮮油橄欖果實(shí)中冷榨提取的一種高檔食用植物油，其富含不飽和脂肪酸（油酸占55%～83%）、角鯊烯、多酚以及維生素，具有抗氧化、調(diào)節(jié)膽固醇、預(yù)防癌癥、美容的功效和調(diào)整人體生理機(jī)能的作用[2]。另一方面，初榨橄欖油青草般的“綠色”風(fēng)味在消費(fèi)者偏愛(ài)程度以及橄欖油質(zhì)量評(píng)價(jià)上具有重要的地位，這種“綠色”風(fēng)味源于油中的多酚和復(fù)雜的揮發(fā)性化合物。Angerosa[3]等對(duì)初榨橄欖油風(fēng)味起源和成分的研究表明，這些揮發(fā)性化合物主要是脂氧合酶途徑（Lipoxygenase pathway）合成的 C5、C6的醛和醇，以及它們相應(yīng)的酯類(lèi)化合物，脂氧合酶途徑的具體反應(yīng)過(guò)程如圖1所示。

圖1 脂肪合酶途徑

與歐洲國(guó)家相比，目前中國(guó)境內(nèi)的油橄欖種植面積和橄欖油產(chǎn)量還非常有限，中國(guó)市場(chǎng)上橄欖油的供應(yīng)95%還依賴國(guó)外進(jìn)口。此外，我國(guó)油橄欖種植和橄欖油加工環(huán)節(jié)均缺少科學(xué)規(guī)劃，管理粗放。個(gè)別加工廠過(guò)度追求出油量，農(nóng)戶采摘油橄欖后企業(yè)加工廠一次性大規(guī)模收購(gòu)，長(zhǎng)時(shí)間露天堆放，微生物發(fā)酵現(xiàn)象嚴(yán)重；在油橄欖加工技術(shù)參數(shù)方面至今沒(méi)有具體的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，加工條件具有很大的隨意性和不確定性。這些諸多問(wèn)題都會(huì)影響到橄欖油的質(zhì)量指標(biāo)和風(fēng)味品質(zhì)，甚至帶來(lái)令消費(fèi)者難以接受的感官風(fēng)味。另一方面，我國(guó)引進(jìn)的油橄欖品種繁多，各品種不易區(qū)分鑒定，品種資源特征信息數(shù)據(jù)匱乏。針對(duì)以上現(xiàn)實(shí)問(wèn)題，本文采用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用（HS-SPME-GC／MS）技術(shù)，結(jié)合保留指數(shù)（Retention index，RI）方法分離鑒定了武都境內(nèi)大規(guī)模種植的油橄欖的初榨橄欖油，以及西班牙原裝進(jìn)口特級(jí)初榨橄欖油的風(fēng)味成分，以期為國(guó)內(nèi)初榨橄欖油生產(chǎn)加工過(guò)程中的品質(zhì)評(píng)價(jià)與控制提供參考，為建立本土油橄欖和橄欖油特征信息數(shù)據(jù)庫(kù)和油橄欖品種溯源等方面提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 主要原料、試劑

油橄欖原料采自甘肅省隴南市武都區(qū)大堡油橄欖試驗(yàn)園，試驗(yàn)共采摘6個(gè)品種：鄂植8號(hào)、皮削利、佛奧、阿斯、萊星、城固32號(hào)，均為隴南市大規(guī)模種植的優(yōu)良品種，每個(gè)品種取500 g油橄欖，要求新鮮，無(wú)蟲(chóng)斑和缺陷，也不要與土壤接觸；國(guó)產(chǎn)混合品種的初榨橄欖油（成品油）由隴南市田園油橄欖科技開(kāi)發(fā)有限公司提供；已確認(rèn)合格的西班牙原裝進(jìn)口初榨橄欖油由國(guó)家糧食局科學(xué)研究院糧油檢驗(yàn)測(cè)試中心提供；C5～C20正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。其他試劑為分析純。

1.1.2 主要儀器、設(shè)備

Waring實(shí)驗(yàn)室均質(zhì)機(jī)；Allegra 64R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：國(guó)華電器有限公司；Lambda 45紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：Derkin Elmer公司；Agilent 7890A-5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀：美國(guó)安捷倫公司；固相微萃取器手柄，30／50μm DVB／CAR／PDMS萃取頭：美國(guó)Supelco公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 初榨橄欖油提取工藝

油橄欖→去枝葉→清洗→破碎→攪拌融合→離心分離→初榨橄欖油[4]。攪拌融合 30 min，溫度30℃，攪拌程序能促進(jìn)油滴融合，顯著提高出油率；離心機(jī)轉(zhuǎn)速5 000 r／min，離心溫度25℃；初榨橄欖油提取之后置于-4℃的冰箱中冷藏。

1.2.2 酸值、過(guò)氧化值和紫外吸光度的測(cè)定

酸值、過(guò)氧化值和紫外吸光度的測(cè)定按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[5-7]。

1.2.3 頂空固相微萃取條件

為了減少分析中的雜質(zhì)峰，20 mL頂空瓶和聚四氟乙烯隔墊使用前應(yīng)清洗干凈，然后在100℃的烘箱中干燥3 h。稱取2.00 g油樣置于頂空瓶中，用隔墊密封。將頂空瓶置于40℃恒溫水浴平衡20 min后，通過(guò)隔墊插入已活化好的SPME萃取頭（270℃，1 h），在70℃下頂空吸附40 min，之后再插入GC進(jìn)樣口，在250℃下解析3 min。注意在萃取頭插入進(jìn)樣口的同時(shí)啟動(dòng)儀器采集數(shù)據(jù)，在2次樣品分析之間都要再次處理萃取頭，防止空氣中的氣體吸附。

1.2.4 GC-MS條件

氣相色譜條件：DB-5MS彈性毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25μm），柱溫升溫程序：40℃，保持2 min，然后以5℃／min升到220℃，保持10 min；進(jìn)樣口溫度：250℃；載氣為高純He，流速1 mL／min；進(jìn)樣方式：不分流。質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源（EI），電子能量70 ev，燈絲發(fā)射電流200μA；離子源溫度：150℃；接口溫度：280℃；全掃描模式，掃描質(zhì)量范圍 m／z35～350 amu。

1.2.5 揮發(fā)性風(fēng)味成分的定性與定量

未知化合物經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索與NIST 2008和Wiley 7標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)相匹配，對(duì)于正反匹配度都大于800（最大值1 000）的匹配結(jié)果，計(jì)算RI，然后分別檢索其相應(yīng)文獻(xiàn) RI（http：／／webbook.nist.gov／chemistry／）。以RI匹配最好的化學(xué)結(jié)構(gòu)作為最佳鑒定結(jié)果，若無(wú)RI文獻(xiàn)值可以參考，只報(bào)道質(zhì)譜匹配度最高的化合物；對(duì)于正反匹配度小于800的匹配結(jié)果視為未知物質(zhì)，暫不報(bào)道。RI的測(cè)定：用同樣的GC／MS條件進(jìn)樣分析C5～C20正構(gòu)烷烴混標(biāo)，記錄各正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間，用線性升溫公式[8]RI＝100n＋100（tx-tn）／（tn＋1-tn）計(jì)算各成分的 RI，其中tx，tn和tn＋1分別為被分析組分和相鄰碳數(shù)正烷烴 （tn＜tx＜tn＋1）流出峰的保留時(shí)間。各組分峰的相對(duì)含量采用總離子流圖峰面積歸一化法確定。

2 結(jié)果與討論

2.1 初榨橄欖油樣品主要品質(zhì)指標(biāo)

本試驗(yàn)所用油樣的酸值、過(guò)氧化值和紫外吸光度如表1所示。從各指標(biāo)數(shù)值可知所有初榨橄欖油均符合特級(jí)初榨橄欖油的等級(jí)要求（酸度≤0.8%，過(guò)氧化值≤10 mmol／kg，K232≤2.50，K270≤0.22）。

表1 油樣的主要品質(zhì)指標(biāo)

2.2 頂空固相微萃取條件優(yōu)化

溫度影響待測(cè)組分在樣品基質(zhì)、氣體頂空和纖維涂層三者之間的化學(xué)平衡，從而對(duì)SPME萃取效果影響較大。過(guò)高的溫度有利于揮發(fā)性化合物從基質(zhì)中釋放出來(lái)，增加頂空中目標(biāo)物的濃度，但同時(shí)也會(huì)使待測(cè)成分在纖維涂層與頂空間的分配系數(shù)降低，減小涂層對(duì)待測(cè)成分的吸附量[9]。本試驗(yàn)研究了不同萃取條件下?lián)]發(fā)性化合物總峰面積、C5和C6化合物峰面積的變化規(guī)律，結(jié)果如圖2、圖3所示。總峰面積隨吸附溫度的升高逐漸增大，70℃之后達(dá)到穩(wěn)定。C6化合物的吸附在50℃達(dá)到飽和，超過(guò)70℃吸附量下降。與C6化合物相比，C5化合物吸附量較小，且隨吸附溫度上升峰面積逐漸下降。綜合考慮，將70℃定為最佳的吸附溫度。根據(jù)圖3的結(jié)果，C5、C6化合物峰面積、總峰面積均在40 min后達(dá)到穩(wěn)定，故吸附時(shí)間確定為40 min。

圖2 吸附溫度對(duì)SPME的影響

圖3 吸附時(shí)間對(duì)SPME的影響

2.3 不同品種油橄欖的初榨橄欖油中揮發(fā)性風(fēng)味成分的鑒定

按照優(yōu)化后的SPME條件對(duì)初榨橄欖油揮發(fā)性成分進(jìn)行GC-MS分離鑒定，得到初榨橄欖油香氣成分的總離子流圖（見(jiàn)圖4）。除去少量分析時(shí)萃取頭涂層和柱流失帶來(lái)的硅氧烷類(lèi)（典型碎片 m／z 208）和鄰苯二甲酸酯類(lèi)（典型碎片m／z 149）的雜質(zhì)峰[10]，在6個(gè)品種初榨橄欖油的香氣中共分離鑒定出86種化合物，經(jīng)鑒定并采用面積歸一化法計(jì)算各成分的相對(duì)含量，結(jié)果列于表2。

圖4 初榨橄欖油揮發(fā)性風(fēng)味成分總離子流圖

表2 國(guó)產(chǎn)初榨橄欖油揮發(fā)性風(fēng)味成分鑒定及相對(duì)含量

表2 （續(xù)）

表2 （續(xù)）

從各品種香氣的主要構(gòu)成看（見(jiàn)圖5），醛類(lèi)是初榨橄欖油香氣中最主要的化合物，占總香氣成分的34.74%～58.22%。其中（E）-2-己烯醛（7.14%～46.22%）、己醛（1.61%～14.23%）、（E，E）-2，4-庚二烯醛（3.14%～6.10%）和壬醛（0.87%～4.62%）在各品種中含量相對(duì)較高，（Z）-3-己烯醛（3.89%）僅存在于皮削利的香氣中。（Z）-3-己烯醛、己醛和（E）-2-己烯醛來(lái)源于脂氧合酶途徑，是初榨橄欖油青草味、果香以及苦味的主要貢獻(xiàn)者[11-12]，其含量在各品種間差異很大，這是由于每個(gè)品種中合成這些C6醛類(lèi)的酶活性或含量存在差別，而這種差別又是由其基因決定的[3，13-14]。除了城固32號(hào)，其他品種中（E）-2-己烯醛含量均高于己醛，這反映出在脂氧合酶途徑中（E）-2-己烯醛／（E）-2-己烯醇支鏈相對(duì)于己醛／1-己醇支鏈的主導(dǎo)地位[15]。主要的醇類(lèi)化合物有（Z）-3-己烯-1-醇（nd～13.16%）、（E）-2-己烯 -1-醇（0.58%～11.64%）和1-己醇（1.32%～5.24%），這些C6醇類(lèi)是乙醇脫氫酶（ADH）催化相應(yīng)醛的產(chǎn)物，具有新切的青草味和香蕉味[11-12]。值得注意的是，混合品種和萊星的香氣中并未出現(xiàn)（Z）-3-己烯-1-醇，這與Angerosa等[15]對(duì)意大利境內(nèi)該品種的研究結(jié)論相同。除了C6醇類(lèi)，苯乙醇也以較高的含量（1.36%～8.60%）出現(xiàn)在所有品種中，這在以前研究歐洲橄欖油香氣的文獻(xiàn)中并未發(fā)現(xiàn)。酯類(lèi)化合物如（Z）-乙酸-3己烯酯（nd～5.62%）、乙酸己酯（nd～1.41%）和（E）-乙酸 -2-己烯酯（nd～0.31%），這些酯都是乙醇酰基轉(zhuǎn)移酶（AAT）催化相應(yīng)底物酯化的結(jié)果，普遍較低的產(chǎn)物含量也說(shuō)明了在所有品種中AAT的活性并不高。除了大部分來(lái)自脂氧合酶途徑的化合物外，還有一些含量較高的烯烴和萜烯化合物被分離鑒定出。高水平的苯乙烯（佛奧16.82%）和（E）-2-十二碳烯（皮削利14.19%）在國(guó)外相關(guān)文獻(xiàn)中鮮見(jiàn)報(bào)道過(guò)，其來(lái)源有待于進(jìn)一步研究。此外還有一些萜烯類(lèi)如（E）-β-羅勒烯（0.26%～4.59%）、α-檸檬烯（0.29%～1.15%）、α-蒎烯（nd～1.08%）和α-法呢烯（nd～8.30%）也被鑒定出，這些化合物的含量很大程度上取決于品種效應(yīng)，可以作為橄欖油品種和產(chǎn)地的標(biāo)記物[16-17]。

圖5 不同品種香氣的主要構(gòu)成

2.4 西班牙初榨橄欖油中揮發(fā)性風(fēng)味成分的鑒定

目前原裝進(jìn)口到中國(guó)的西班牙特級(jí)初榨橄欖油大多數(shù)來(lái)自混合品種油橄欖的果實(shí)，這些油橄欖有可能收購(gòu)自不同的國(guó)家，提取得到油被稱為商業(yè)特級(jí)初榨橄欖油，這種油在中國(guó)市場(chǎng)上形成了壟斷。為了與國(guó)產(chǎn)初榨橄欖油區(qū)分，本試驗(yàn)在研究的6個(gè)油樣中共鑒定出101種化合物，其中含量較高的化合物列于表3中。在這些油中乙酸（1.30%～6.50%）、乙酸乙酯（0.48%～2.79%）的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于國(guó)產(chǎn)初榨橄欖油（0.27%～1.47%、nd～0.25%），它們可能是酵母菌大量繁殖而產(chǎn)生的的代謝產(chǎn)物[3]。己醛（1.19%～2.46%）、（E）-2-己烯醛（1.76%～5.25%）的質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯低于國(guó)產(chǎn)初榨橄欖油，尤其是（E）-2-己烯醛。除了單一品種皮庫(kù)多外，混合品種的（Z）-乙酸-3-己烯酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（7.53%～13.76%）都超過(guò)了國(guó)產(chǎn)初榨橄欖油，這種化合物具有綠色香蕉和綠葉的香氣[11-12]。此外，值得注意的是，（E）-2-十二碳烯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（5.47%～34.75%）顯著高于大多數(shù)國(guó)產(chǎn)初榨橄欖油。

表3 西班牙特級(jí)初榨橄欖油主要揮發(fā)性風(fēng)味成分鑒定及相對(duì)含量

3 結(jié)論

采用HS-SPME-GC／MS分離鑒定了武都初榨橄欖油、西班牙特級(jí)初榨橄欖油的揮發(fā)性風(fēng)味成分。在7個(gè)不同品種的武都初榨橄欖油中共鑒定出86種化合物，主要是C6的醛和醇，以及它們相應(yīng)的酯，還有一些烯烴和萜烯類(lèi)化合物；在6個(gè)西班牙特級(jí)初榨橄欖油中共鑒定出101種化合物，其中的（E）-2-己烯醛的相對(duì)含量（1.76%～5.25%）低于國(guó)產(chǎn)初榨橄欖油（7.14%～46.22%），而（Z）-乙酸 -3-己烯酯（7.53%～13.76%）和（E）-2-十二碳烯（5.47%～34.75%）相對(duì)含量較高。試驗(yàn)結(jié)果還表明，初榨橄欖油揮發(fā)性成分很大程度上取決于油橄欖品種和產(chǎn)地。

[1]王貴禧，俞寧，鄧明全，等.中國(guó)油橄欖發(fā)展概況[J].林業(yè)科技通訊，2000，1：32-34

[2]鐘昌勇.橄欖油化學(xué)組成及應(yīng)用綜述[J].林產(chǎn)化工通訊，2005，39（6）：34-38

[3]Angerosa F，ServiliM，Selvaggini R，et al.Volatile compounds in virgin olive oil：occurrence and their relationship with the quality[J].JChromatogr A，2004，1054（1）：17-31

[4]鄧叢靜，于小飛，陳軍，等.橄欖油加工工藝及品質(zhì)評(píng)價(jià)[J].林產(chǎn)工業(yè)，2011，38（1）：62-63

[5]GB／T 5530—2005／ISO 660—1996，動(dòng)植物油脂 酸值和酸度測(cè)定[S]

[6]GB／T 5538—2005／ISO3960—2001，動(dòng)植物油脂 過(guò)氧化值測(cè)定[S]

[7]GB／T 22500—2008／ISO3656—2002，動(dòng)植物油脂 紫外吸光度的測(cè)定[S]

[8]Van Den Doolh，Dec Kratzp.A generalization of the retention index system including linear temperature programmed gasliquid partition chromatography[J].J Chromatogr，1963（11）：463-471

[9]Zhang Z，Yang M J，Pawliszyn J.Solid-phase microextraction.A solvent-free alternative for sample preparation[J].Anal Chem，1994，66：844-853

[10]田懷香，王璋，許時(shí)嬰.頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法分離鑒定金華火腿的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[J].色譜，2006，24（2）：177-180

[11]Morales M T，Alonso M V，Rios J J，et al.Virgin olive oil aroma：relationship between volatile compounds and sensory attributes by chemometrics[J].JAgric Food Chem，1995，43（11）：2925-2931

[12]Garcia-Gonzalez D L，Tena N，Aparicio R.Characterization of olive paste volatiles to predict the sensory quality of virgin olive oil[J].Eur JLipid Sci Technol，2007，109（7）：663-672

[13]Kiritsakis A K.Flavor components of olive oil-A review[J].JAm Oil Chem Soc，1998，75（6）：673-681

[14]Kalua CM，Allen M S，Bedgood Jr D R，etal.Olive oil volatile compounds，flavour development and quality：a critical review[J].Food Chem，2007，100（1）：273-286

[15]Angerosa F，Basti C，Vito R.Virgin olive oil volatile compounds from lipoxygenase pathway and characterization of some Italian cultivars[J].J Agric Food Chem，1999，47（3）：836-839

[16]Luna G.Characterisation of monovarietal virgin olive oils[J].Eur JLipid Sci Technol，2002，104：614-627

[17]Temime S B，Campeol E，Cioni P L，et al.Volatile compounds from Chétoui olive oil and variations induced by growing area[J].Food Chem.2006，99（2）：315-325.