T1脂肪酶催化合成甘油酯過程酯化率變化規律研究

鐘金鋒 覃小麗， 王永華

（西南大學食品科學學院1，重慶 400715）

（華南理工大學輕工與食品學院2，廣州 510640）

甘油酯是一系列食品、藥物、化妝品中常用的功能性添加劑[1-2]，因此，高效地制備高品質的甘油酯是油脂工業的研究熱點之一。與傳統化學合成法存在反應溫度高、設備腐蝕嚴重、產品難以分離等特點相比，酶法催化合成甘油酯過程反應條件溫和、產物選擇性強，設備要求低而頗受研究者的關注[3-5]。

目前，國內外研究酶法催化合成甘油酯研究中主要采用商業化脂肪酶如Novozym 435、Lipozyme TL IM和Lipozyme RM IM，其成本較高，所以不斷發現和研究新型脂肪酶，探索新型脂肪酶分離純化、固定化、催化作用機理及其潛在應用成為酶工程研究重點之一。T1脂肪酶從Geobacillus zalihae strain T1分離得到，是一種新型脂肪酶，其在較高的反應溫度（60℃）下保持較高的酶活性[6]，因此，T1脂肪酶在油脂改性工業具有較好的應用前景。目前，國內外關于T1脂肪酶的研究主要集中在T1脂肪酶的高效表達、分離純化[7]、酶學性質[6]及分子催化機理方面的研究[8]，而對于T1脂肪酶的應用研究，尤其是在油脂改性方面的報道較少。本課題組前期工作中采用T1脂肪酶催化高熔點油脂（棕櫚硬脂）的水解反應制備甘油二酯，結果顯示水解產物中甘油二酯含量相對較低（28%）[9]。

為了進一步研究T1脂肪酶在油脂改性方面的潛在應用，提高T1脂肪酶催化反應速率，增加目標產物甘油酯的含量，本研究以油酸和甘油為反應底物，以自制T1脂肪酶為催化劑，通過直接酯化反應的方式制備甘油酯，考察不同反應條件對油酸酯化率的影響及油酸酯化反應轉化為甘油酯的動力學方程，通過規劃擬合求解確定方程各階段的反應系數，分別探討各反應條件與對應動力學方程系數的關系，以期獲得T1脂肪酶通過酯化法催化合成甘油酯的動態反應歷程的變化規律，為研究各個目標產物（如甘油一酯和甘油二酯）的變化規律奠定基礎，為將來T1脂肪酶應用于甘油酯合成的工業化進行最優化設計及最佳控制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌 pET-23a-CBD-T1-BL21由本課題組提供[9]；油酸（＞76%，分析純）：上海晶純試劑有限公司；胰蛋白胨和酵母提取物：OXOID公司；三油酸甘油酯，甘油二酯（由15%的1，2-二油酸甘油二酯和85%的1，3-二油酸甘油二酯組成）、單油酸甘油酯標準品：Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 T1脂肪酶制備及酶活測定[9]

制備步驟：將含有重組質粒的pET-23a-CBD-T1-BL21菌種按2%接種量接種于LB培養基（蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化鈉0.5%，W／V）中，加入氨芐青霉素使其終濃度為100μg／mL，置于在37℃搖床（200 r／min）培養。當培養至 OD600＝0.6～0.8，加入誘導劑 IPTG使其終濃度為 0.05 mmol／L，然后將其置于20℃繼續培養12 h后離心（4℃，12 857×g，20 min）收集菌體。用 PBS緩沖溶液（137 mmol／L NaCl，2.7 mmol／L KCl，10 mmol／L Na2HPO4，2 mmol／L KH2PO4，pH 7.4）重懸菌體，然后將重懸液置于冰水浴中進行細胞破碎（超聲波破碎儀的功率250W，脈沖3 s，間隔3 s，15 min）。對離心（4℃，12 857×g，20 min）后細胞裂解液上清液進行真空冷凍干燥，凍干后得到的酶粉為T1脂肪酶粗酶。

測定方法：將甘油（29.34 mmol）和油酸按物質的量比2∶1混合添加到25 mL帶塞三角瓶并充分混合，加入適量的粗酶（精稱0.13 g）和7%（占底物質量）的 Tris-HCl緩沖液（50 mmol／L，pH 9.0），置于溫度為60℃的恒溫磁力攪拌器（542 r／min）中反應20 min。反應初始和20min時取樣離心（6 950×g，10 min），精確稱取0.1 g油相（上層）并充分溶于異丙醇（25 mL）中，以1%酚酞為指示劑，以KOH標準溶液（0.1mol／L）滴至紅色時為滴定終點（30 s不褪色），記錄KOH消耗量。每個樣平行測定2～3次，測定結果取其平行測定的算術平均值。

1.2.2 酶促酯化反應

反應在25 mL具塞錐形瓶中進行。將甘油和油酸按一定物質的量比添加到錐形瓶中，分別加入粗酶（9.7 U／g，占總底物質量）和一定量的Tris-HCl緩沖液，在一定溫度的水浴攪拌器（542 r／min）中反應，在 0、3、6、9和 12 h時取樣，離心（6 950×g，10 min）后取油相進行色譜分析酯化產物組成。同一條件進行2次平行試驗，以2次測定結果的算術平均值為最終測定結果。

1.2.3 酯化產物組成分析

樣品處理：取20μL油相（上層）酯化產物于1.5 mL進樣品中，用1 mL流動相充分溶解。采用高效液相色譜法—示差檢測器（HPLC-RID）對酯化產物組成進行分析。其分析條件為：Waters 1525型HPLC；檢測器，2414示差檢測器；色譜柱，Luna 5u Silica（2）100A，250 mm ×4.60 mm i.d.（phenomenex）；柱溫，35℃；流動相，正己烷／異丙醇／甲酸（15∶1∶0.003，體積比），流速 1.0 mL／min；進樣量，10 μL。采用面積歸一化法定量，得到反應混合物中油酸的相對含量，根據式（1）計算油酸的酯化率：

式中：F0為應初始（t＝0）時底物中油酸的相對含量；F1為反應一段時間后反應混合物中油酸的相對含量。

2 結果與討論

2.1 T1脂肪酶催化甘油與油酸合成甘油酯過程油酸酯化率變化規律

攪拌轉速和酶添加量分別固定為542 r／min和9.7 U／g底物，分別考察了水添加量、反應溫度、甘油與油酸物質的量比對酯化率的影響，結果見圖1。

圖1 不同反應條件對T1脂肪酶促合成甘油酯過程中油酸酯化率的影響

從圖1可知，隨著水添加量增大，油酸酯化率呈現先增大后減小的趨勢，說明了添加適量水有利于油酸向甘油酯的轉化，但是當水添加量超過一定量時，則不利于反應朝著正反應方向進行；反應溫度從40℃提高到60℃時，油酸酯化率呈現逐漸增大的趨勢，當溫度到70℃時，油酸酯化率急劇下降；隨著甘油／油酸物質的量比的增大，油酸酯化率呈現一直增大的趨勢。由圖1分析可知，反應過程因素水添加量、反應溫度、甘油／油酸物質的量比對油酸酯化率有不同程度的影響。

2.2 T1脂肪酶催化合成甘油酯過程中油酸變化動力學方程的建立

油酸（A）與甘油（B）在T1脂肪酶催化作用下合成甘油酯（C），如式（2）所示。在本試驗中，甘油與油酸的物質的量比設置為2∶1～6∶1，在整個催化合成過程中，甘油的濃度相對于油酸的濃度始終是過量的，而且甘油濃度要大于甘油酯的濃度。因此，假設本反應中T1脂肪酶催化反應近似為單底物催化反應過程，假設其遵循一級反應動力學。根據反應動力學的基本原理，油酸酯化率方程表示為：

式中：Er為油酸的酯化率／%；CE為理論上反應達平衡狀態下的油酸的最大酯化率／%；k為反應速率常數／h-1；t為反應時間／h。

從圖1可知，在酶催化的初始階段，尤其是在水添加量較少、反應溫度較低、甘油／油酸物質的量比較小的情況下，酶活性的完全發揮需要一定的延遲時間，因此，引入一個新的時間參數——t0，代表T1脂肪酶催化過程中酶活性發揮所需要的延遲時間，對式（3）進行修正，更利于方程反映實際反應過程，因此，式（3）可改寫為：

式（4）是T1脂肪酶催化合成甘油酯過程中油酸酯化率變化的動力學模型。

2.3 反應動力學方程計算值與試驗值的比較與驗證

通過考察圖1不同反應條件下的油酸的酯化率的數據，并以此為基礎，對不同反應條件的數據分別對式（4）進行規劃擬合求解，求出各階段對應的方程系數后，建立了各個反應階段對應的反應動力學方程表達式，以探討不同反應條件對合成甘油酯過程中反應速率和油酸酯化率的影響。

將相應的動力學系數代入式（4）后，計算得到油酸酯化率的系列理論計算值，并對油酸酯化率的實驗值作圖，其關系如圖2所示。由圖2可知，兩者之間的線性相關系數為R2＝0.996，由此可知，依據動力學模型計算得到的油酸酯化率理論值與試驗所測的酯化率實測值之間具有較好一致性，這說明了前面假設本反應近似等于一級反應動力學是合理的，該動力學模型的建立能較好反映本試驗條件范圍內T1脂肪酶催化甘油與油酸合成甘油酯反應過程中油酸酯化率的變化規律，表明了建立的動力學模型的可靠性。因此，需進一步探討對各反應條件與動力學方程系數之間的關系。

圖2 油酸酯化率的試驗測定值與動力學模型計算值之間比較

2.4 反應條件對T1脂肪酶催化合成甘油酯過程油酸酯化率變化規律的分析

2.4.1 水添加量對油酸酯化率變化的影響規律

圖3是水添加量對油酸酯化率變化影響規律示意圖。由圖3a可知，水添加量對酶催化合成甘油酯過程的反應速率常數k的影響較大；當水添加量為4%時，其反應速率常數k為0.195 7 h-1，k值隨著水添加量增大而增大，但是當水添加量超過到一定數值（＞7%）后，k呈現下降趨勢，這意味著為了獲取合適的反應速率，水添加量要控制在合適范圍之內。CE則隨著水添加量增大呈現近似于線性下降的趨勢（圖3a）。這主要由于脂肪酶在反應初始階段需要適量水分以保持其活性的三維結構狀態，然而過多的水添加量及反應后期生成的水分影響熱力學反應，同時限制了疏水性底物在酶分子附近的溶解性[10]。因此，在生產過程中，需要選擇合理的水添加量，確保提高反應速率的同時通過抽真空或加分子篩的措施控制反應體系中水分，從而推動反應向正方向進行，提高反應底物的轉化率。由圖3b可知，當水分含量從4%提高到5%時，t0隨著水添加量增大而增大，但是，水添加量增大到一定程度后（≥6%），t0呈現下降趨勢，這說明使T1脂肪酶酶活充分發揮，需要考慮選擇合適的水添加量。

圖3 水添加量對酯化反應的影響

2.4.2 反應溫度對油酸酯化率變化的影響規律

圖4是反應溫度對油酸酯化率變化影響規律示意圖。由圖4a可知，反應速率常數k隨著溫度的升高呈現先升高后降低的趨勢，這說明反應溫度對k值的影響較大。在較低反應溫度下，酶催化的反應速率較慢；隨著溫度的升高，酶催化的反應速率逐漸增大，但當超過一定溫度（＞60℃）后，k值呈現急劇下降趨勢，這主要由于過高的溫度造成了酶蛋白變性，酶活力下降，影響了酶催化反應速率。當溫度從40℃增加至60℃，CE值從62.79%增加到68.05%；當溫度增加到70℃時，CE值急劇下降到11.66%，這說明了在合適的范圍（40～60℃），增加溫度，有助于提高油酸轉化為甘油酯，但是溫度過高（70℃）容易影響酶活性，進而影響理論上平衡時油酸最大酯化率。由圖4b可知，t0隨著溫度升高而呈現先增大后減小的趨勢，這說明在加熱過程中t0受到溫度影響較大，當溫度超過50℃時，t0下降得較快，說明了溫度對t0的影響也比較明顯，在T1脂肪酶應用過程中，需要綜合考慮甘油酯得率與反應速率的整體需要而選擇合適的反應溫度。

圖4 反應溫度對酯化反應的影響

2.4.3 底物物質的量比對油酸酯化率變化的影響規律

圖5 底物物質的量比對酯化反應的影響

圖5是甘油／油酸物質的量比對油酸酯化率變化影響規律示意圖。由圖5a可知，反應速率常數k值隨著底物物質的量比的增大而不斷增大，這說明了增大甘油的量有助于提高T1脂肪酶催化反應速率。當甘油用量增大到一定程度后，k值的增大趨于平緩。由圖5a可知，T1脂肪酶催化合成甘油酯過程的油酸最大酯化率與底物物質的量比密切相關。隨著甘油用量的增大，反應朝著生成甘油酯的方向進行，使得平衡時底物的最大酯化率有所提高。因此，在T1酶催化反應過程中，為了獲取合適的反應速率和平衡時油酸的最大酯化率，以及綜合考慮底物的成本，需要選擇合適的底物物質的量比使得該反應處于合理的控制范圍。從圖5b可知，t0隨著底物物質的量比的增大呈現下降趨勢，這說明了甘油用量的增大，有助于提高T1脂肪酶催化的反應的速率提高的同時，也有助于減少該過程抑制酶活發揮所需的加熱時間。

3 結論

研究了水添加量、反應溫度、底物物質的量比對T1脂肪酶催化合成甘油酯過程中油酸酯化率的影響?；诒驹囼灥臈l件，得到了反應條件對油酸酯化率系列試驗數據。同時，從反應的基本原理出發，推導并假設該反應遵循一級反應動力學。結合試驗數據和推導的動力學方程，通過規劃求解得到油酸酯化率動力學反應方程 Er＝CE×[1-e-k（t-t0）]的對應的方程系數值：反應速率常數k，理論上平衡時油酸最大酯化率CE，酶活發揮延遲時間t0。通過對比動力學方程計算得到的油酸酯化率理論值與油脂酯化率的實驗測定值，兩者的相關系數為0.996，驗證了該反應過程是符合一級反應動力學方程，說明了該方程可較好反映該過程中油酸酯化率的變化規律。最后，將方程系數對反應影響因素作圖，得到了反應條件對對應的動力學方程系數的影響程度各不相同，由這些數據可知，要得到合適的甘油酯得率、反應速率和利于T1脂肪酶酶活的發揮，就要結合試驗數據選擇合適的反應條件。

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