高壓CO2對水酶法乳狀液破乳影響的研究

韓宗元 江連洲 李 楊 齊寶坤 王中江 王勝男

（東北農業大學食品學院1，哈爾濱 150030）

（沈陽工學院生命工程學院2，撫順 150030）

在水酶法提取大豆油脂過程中，乳狀液破乳是十分關鍵的步驟，破乳越徹底大豆油的提取率越高。化學破乳主要是加破乳劑[1]。物理破乳包括靜電場、微波、冷凍解凍、超聲波破乳[2-5]。生物破乳主要是酶法破乳[6]。Nastaran等[1]提出吐溫試劑作為高分子量化學破乳劑可以提高乳狀液破乳率。Kuo等[7]指出微波產生的熱量可以更快地去除水分，破壞電解質平衡，破乳率可達到90%。Wu等[6]利用不同酶對大豆乳狀液進行破乳，比較各種酶的破乳效果。水酶法是一種綠色、環保的提油工藝，可以避免油脂提取過程中使用有機溶劑和有毒有害化學試劑。

高壓CO2作為一種新興的物理方法主要作用于蛋白沉降[8]。Nawal等[8]利用高壓 CO2沉降大豆蛋白，使pH值降至3～5以加快蛋白沉降從而釋放油脂[6]。Nael等[9]證明 CO2可以對油包水型乳狀液進行破乳，增加CO2的壓力和停留時間可以提高沉降速率，加速破乳過程。因此，高壓CO2可以通過沉降乳狀液中蛋白有效地進行破乳，而且作用時間短，效果明顯。本研究目的：1）通過設計響應面優化試驗對高壓CO2壓力、溫度、處理時間、濃度進行優化，得到最優結果，將其應用到油脂破乳過程中，提高油脂提取率；2）通過透射電鏡觀察高壓CO2破乳過程，掌握破乳前后乳狀液變化情況，有助于高壓CO2破乳參數的優化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆：吉林風正食品有限公司；Protex6L堿性蛋白酶：諾維信公司；LDZ5-2型臺式低速離心機：上海安亭科學儀器廠；pHS-3C型酸度計：上海雷磁儀器廠；CO2（純度99.5%）：北京醫療設備二廠；耐高壓不銹鋼鍋（1 200 mL）、數顯溫度調節計、數顯壓力調節計：上海一恒科學儀器有限公司；數顯流量調節計：常州國華電器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 高壓CO2破乳

大豆壓片粉碎后過60目篩，將過篩后物料與水混合得到混合液，向混合液中加入Protex6L堿性蛋白酶進行酶解，酶解后5 000 r／min離心分離得到游離油、乳狀液、水解液與殘渣；提取乳狀液與水解液并放入高壓CO2耐高壓不銹鋼鍋中，通入一定量CO2進行破乳，利用溫度、壓力和流量調節計控制參數。破乳后，在4 500 r／min下離心分離15 min后得到大豆油脂。

1.2.2 單因素試驗

高壓CO2溫度150℃、濃度0.5 g／cm3、作用時間21 s、壓力14 MPa。保證3個因素不變，只改變1個因素，通過研究CO2壓力為8～20 MPa，蒸汽溫度為120～190℃，蒸汽處理時間12～30 s，CO2濃度0.1～0.8 g／cm3確定各因素對破乳率的影響。

1.2.3 響應面優化試驗

選取高壓CO2溫度、濃度、作用時間、壓力4個因素為自變量，以破乳率為響應值，根據中心組合設計原理，設計響應面分析試驗，見表1。

表1 因素水平編碼表

1.2.4 破乳率的測定

檢測方法及計算參考文獻[6]。

破乳率＝破乳后油的質量（g）／乳狀液中油的質量（g）×100%

1.2.5 透射電鏡

前固定→漂洗→后固定→漂洗→50%乙醇脫水→70%乙醇脫水→90%乙醇脫水→100%乙醇脫水→100%乙醇和100%丙酮（1∶1）脫水→100%丙酮脫水→純丙酮和包埋液浸透→包埋→聚合→修塊→超薄切片機切片→染色→觀察、拍片。

1.3 數據處理

所有試驗數據均為“平均值±標準差”，n＝3。采用SAS9.18統計分析軟件對試驗數據進行分析。

2 結果與討論

2.1 高壓CO2破乳單因素條件對破乳率的影響

2.1.1 高壓CO2溫度對破乳率的影響

由圖1可以看出，高壓CO2溫度高于130℃時破乳率明顯增加，但當溫度超過160℃時，破乳率開始大幅降低，可見溫度對破乳率影響很大，因為CO2在130～160℃時，易溶于水，使pH降低，達到等電點，從而加快蛋白沉降，超過160℃時，CO2溶解度降低，導致蛋白沉降減慢使破乳率降低。因此蒸汽溫度選擇130～170℃。

圖1 高壓CO2溫度對破乳率的影響

2.1.2 高壓CO2濃度對破乳率的影響

由圖2可以看出，濃度在0.5 g／cm3附近破乳率有最大值出現，濃度過高不利于 CO2溶解，導致蛋白沉降減慢，從而影響破乳率，所以選擇濃度0.3～0.7 g／cm3。

圖2 高壓CO2濃度對破乳率的影響

2.1.3 高壓CO2處理時間對破乳率的影響

由圖3可以看出，當處理時間大于24 s時破乳率明顯降低，因為通入過多CO2，導致CO2析出，降低蛋白沉降速率，所以在響應面試驗設計中處理時間選擇15～27 s。

圖3 高壓CO2作用時間對破乳率的影響

2.1.4 高壓CO2壓力對破乳率的影響

由圖4可以看出，當壓力為14 MPa時破乳率達到最大，因為溶解度和壓力有關，壓力過大使CO2溶解度降低，所以在響應面試驗設計中壓力選擇10～18 MPa。

圖4 高壓CO2壓力對破乳率的影響

2.2 高壓CO2破乳條件的優化

應用響應面優化法進行過程優化，以x1、x2、x3、x4為自變量，以破乳率為響應值y，響應面試驗方案及結果見表2。試驗號1～24為析因試驗，25～36為中心試驗，用以估計試驗誤差。

表2 響應面試驗方案及試驗結果

2.3 響應面試驗結果分析

通過統計分析軟件SAS9.18進行數據分析，建立二次響應面回歸模型。

回歸分析與方差分析結果見表3，交互項顯著的響應面分析見圖5～圖9。

表3 回歸與方差分析結果

由表3可知，方程因變量與自變量之間的線性關系明顯，該模型回歸顯著（P＜0.000 1），失擬項不顯著，并且該模型，說明該模型與試驗擬合良好，自變量與響應值之間線性關系顯著，可以用于該反應的理論推測。由F檢驗可以得到因子貢獻率為：x4＞x1＞x3＞x2，即高壓CO2壓力＞高壓CO2溫度＞高壓CO2作用時間＞高壓CO2濃度。

當固定2個因素的零水平，圖5～圖9表示另外兩個顯著交互項的響應面和等高線。顯著交互項可從表3獲得，分別為：高壓CO2的溫度和濃度，高壓CO2的溫度和作用時間，高壓CO2的溫度和壓力，高壓CO2的濃度和時間，高壓CO2的壓力和時間。圖5表明：當把x3和x4調節到零水平時，高壓CO2的溫度和濃度對破乳率影響的變化趨勢都是先增加后減小。圖6表示當把x2和x4調節到零水平，高壓CO2的溫度和作用時間對破乳率影響的變化趨勢也都是先增加后減小。圖7表明當把x2和x3調節到零水平，高壓CO2的溫度和壓力對破乳率影響的變化趨勢都是先保持穩定后減小。圖8表示當把x1和x4調節到零水平，高壓CO2的濃度和時間對破乳率影響的變化趨勢是先增加后減小。圖9表示當把x1和x2調節到零水平時，高壓CO2的壓力和時間對破乳率影響的變化趨勢逐漸減小。

圖5 高壓CO2的溫度和濃度的交互作用對破乳率的影響

圖6 高壓CO2的溫度和作用時間的交互作用對破乳率的影響

圖7 高壓CO2的溫度和壓力的交互作用對破乳率的影響

圖8 高壓CO2的濃度和時間的交互作用對破乳率的影響

圖9 高壓CO2的壓力和時間的交互作用對破乳率的影響

應用響應面尋優分析方法對回歸模型進行分析，尋找最優響應結果：高壓CO2壓力13.96 MPa，高壓CO2溫度155.64℃，高壓CO2處理時間21.46 s，CO2濃度0.53 g／cm3，響應面最優值（94.88±0.30）%。

2.4 驗證試驗與對比試驗

在響應面分析法求得的最佳條件下，進行3次平行試驗，破乳率的平均值為95.06%。破乳率預測值為（94.88±0.30）%，說明響應值的試驗值與回歸方程預測值吻合良好。

2.5 透射電鏡分析

Wu等[6]研究指出水酶法提取大豆油脂過程中，破乳是關鍵步驟，而大豆乳狀液中含有大豆蛋白，是保持乳狀液穩定的重要成分，采用不同蛋白酶對其乳狀液破乳，使油脂從蛋白包裹中釋放出來。通過透射電鏡觀察，乳狀液內部油脂被大量蛋白包圍，無法聚合在一起釋放出來，所以破乳是油脂釋放的前提。圖10a為破乳前乳狀液中油脂和蛋白分布情況，可發現酶解后細胞壁被破壞，蛋白質大量聚集在一起，油滴被鑲嵌在蛋白中，使油滴很難釋放出來；圖10b為乳狀液經過高壓CO2破乳后的分布情況，包裹油脂的蛋白膜大部分破碎、變小，而油體聚在一起形成油滴，小油滴變大，從包裹的蛋白中釋放出來，并且聚集在一起[3]。通過透射電鏡觀察可以發現高壓CO2可以破壞乳狀液的穩定體系并有效地使油脂從乳狀液中釋放出來，進而解決了乳狀液破乳的難題，最終提高了水酶法提取大豆油脂的提取率。

圖10 乳狀液破乳前后透射電鏡對乳狀液結構分析

2.6 物理破乳方法比較

通過比較表4中4種物理破乳方法對破乳率的作用，得到以下結果：高壓CO2＞微波＞超聲波＞冷凍解凍，說明高壓CO2破乳法比其他物理破乳法的破乳率更高，作用時間短，可以更好地用于水酶法破乳，提高大豆油脂提取率[3-5]。

表4 4種不同破乳方法對破乳率影響

3 結論

本試驗利用響應面分析方法對高壓CO2破乳工藝參數進行了優化，得到最優參數條件：高壓CO2壓力為13.96 MPa，高壓CO2溫度為155.64℃，高壓CO2處理時間 21.46 s，CO2濃度 0.53 g／cm3，響應面最優值（94.88±0.30）%。采用透射電鏡，觀察破乳前后乳狀液中油和蛋白的分布情況，發現高壓CO2可以使蛋白質沉降，進而使乳狀液穩定結構瓦解，油脂正常釋放，解決了水酶法提取大豆油脂的難題，有利于水酶法提取大豆油脂的工業化生產。

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