苦蕎芽粉饅頭體外消化后抗氧化能力研究

許芳溢 李五霞 呂曼曼 馬雨潔 王 敏

（西北農林科技大學食品科學與工程學院，楊凌 712100）

苦蕎是我國的小宗雜糧作物之一，也是公認的藥食同源的食材。苦蕎芽是最近興起的一類廣受市場歡迎的綠色蔬菜，因為苦蕎經過發芽處理之后，種子內部化學組成發生變化，營養價值提高的同時功能性成分增加，還會產生特殊的風味[1]。研究表明，經過萌發處理的蕎麥氨基酸種類增加，含量上升，不飽和脂肪酸的比例增大，生物類黃酮等功能性成分顯著增加，抗氧化活性增強[2-4]。饅頭是我國的傳統主食食品，深受北方居民的歡迎。將苦蕎經過萌動處理之后磨制成粉作為輔料添加到日常食用的饅頭當中，既能照顧北方居民對饅頭的食用習慣，又能滿足長期食用苦蕎對營養與保健的需求，此外還增加了主食饅頭的花色品種，相對于市售的小麥饅頭是一個有益的補充。

目前對蕎麥制品抗氧化能力的測定方法是基于有機溶劑（甲醇、乙醇或丙酮等）對蕎麥進行浸提，得到的提取物用于檢測抗氧化活性[5]。但是有機溶劑畢竟有別于人體的生理環境，體外檢測的結果往往與生物接受率和利用率的實際效果相差十幾倍[6]，并且食品也不可能允許加入甲醇或者乙醇類的提取物。而通過動物或人體試驗，不僅昂貴而且受到各種外部因素的制約。因此本研究通過模擬口腔、胃腸消化以及小腸吸收環境，對苦蕎芽粉饅頭的功能性成分總酚和黃酮以及抗氧化活性進行研究，也為苦蕎芽更廣泛的應用于新型營養保健食品開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

1.1.1 材料

苦蕎：選取具有陜西地區廣泛種植并具有代表性的苦蕎品種西農9940（西農培育品種）；苦蕎芽：苦蕎種子經過萌發處理4 d后采收（芽長約為4 cm），50℃烘箱中烘干備用。

蕎麥籽粒和苦蕎芽經高速萬能粉碎機破碎后，用60目的篩子濾掉殼和部分麩皮，剩余的部分即為試驗中原料粉。小麥粉：市售聚糧農家面（精品特一粉），安琪高活性干酵母。

1.1.2 試劑

蘆丁（質量分數≥98.0%）：國藥集團化學試劑公司；沒食子酸：科邦生物工程有限公司；Folin-Ciocalteu試劑、DPPH·、ABTS、Trolox、胃蛋白酶，α-淀粉酶、胰蛋白酶、膽汁：sigma公司。

1.1.3 儀器

FX-11型面包發酵箱：廣州賽思達機械設備有限公司；FW100型高速萬能粉碎機：北京成萌偉業科技有限公司；WFJ72系列721型可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 饅頭的制作

按照表1所示饅頭的配方制成面團，室溫靜置10 min后放置在37℃，相對濕度為78%的發酵箱中發酵2 h。將發好的面團揉至光滑并整理成圓形后，放入蒸鍋中。涼水上鍋蒸30 min后取出，室溫冷卻1 h，備用。按相同的方法制作小麥饅頭，作為空白對照。

表1 饅頭的配方

1.2.2 體外模擬消化過程

體外模擬消化過程參考Gawlik等[7]的方法，略作修改。

模擬唾液：2.38 g Na2HPO4，0.19 g KH2PO4，8 g NaCl和0.91 gα-淀粉酶（220 U／mL）溶于1 L水中形成模擬唾液，用磷酸鹽緩沖液調節溶液pH為6.75。

模擬胃液：0.32% 胃蛋白酶溶于0.3 mol／L的NaCl，HCl調節溶液 pH＝1.2。

模擬腸液：0.05 g胰蛋白酶和0.3 g膽汁溶于35 mL的 NaHCO3（0.1 mol／L）。

體外提取過程（S0）：準確稱取6.0 g蕎麥饅頭樣品浸沒于100 mL甲醇／水（80／20）溶液中，靜置6 h，懸浮液轉移至離心管中，2 500 r／min離心10 min，取上清液于45℃水浴下旋轉蒸發至干，甲醇重新溶解并定容到10 mL，-20℃保存，備用。

口腔消化過程（S1）：準確稱取6 g樣品置于100 mL的燒杯中并加入30 mL模擬唾液，均質機攪拌使樣品充分破碎均質后放入水浴搖床中，37℃振蕩10 min。

胃腸消化過程（S2）：取出水浴搖床中的樣品，3 mol／L的鹽酸調節溶液體系至pH＝1.5后加入30 mL模擬胃液，置于40℃水浴搖床中振搖60 min。反應結束后取5 mL樣液，于70℃水浴鍋中滅酶，經過模擬胃部消化的消化液用0.1 mol／L的NaHCO3調節使溶液體系pH為6，加入30 mL膽汁-胰酶的復合液，再分別加入 5 mL 1 mol／L的 NaCl和 1 mol／L KCl，置于37℃水浴震蕩120 min模擬腸道消化，于70℃水浴鍋中滅酶，-20℃保存備用。每個樣品重復3次。

腸道吸收過程（S3）：將20 mL剩余消化液轉移到透析袋中，并將透析袋置于裝有50 mL PBS緩沖液的燒杯中，37℃水浴震蕩4 h。將PBS緩沖液轉移到離心管中，-20℃保存備用，每個樣品重復3次。

1.2.3 總黃酮含量的測定

采用NaNO2-Al（NO）3絡合法測定樣品黃酮含量[8]，稍作修改。取消化液 500μL與 500μL 5%NaNO2溶液，漩渦混勻室溫下放置6 min，加入500 μL 10%的AlCl3，振蕩后靜置6 min，再加入2.5 mL 1 mol／L NaOH和1 mL蒸餾水混勻后室溫下避光反應15 min，510 nm波長處測定吸光度。以蘆丁為標準品制作標準曲線，黃酮含量以mg R／100 g DW（干基）表示（R為蘆丁的縮寫）。

1.2.4 總酚含量的測定

采用Folin-Ciocalteu法測定試樣的總酚含量[9]。取500μL蒸餾水，加入250μL提取液后，再加入250μL Folin-Ciocalteu試劑，充分混勻后加入2.5 mL 7%碳酸鈉溶液，漩渦混勻避光放置90 min于760 nm處測定混合液的吸光值。沒食子酸為標準品制定標準曲線，多酚含量以mg GA／100 g DW（GA為沒食子酸的縮寫）。

1.2.5 DPPH·清除能力

清除 DPPH·能力試驗參照 Filipcˇev等[10]的方法并稍作修改，以Trolox為標準品，有所調整后進行試驗。取1 mL稀釋后的饅頭提取液，加入1 mL 125.5μmol／L用甲醇溶解的DPPH·溶液 1 mL，迅速混勻避光放置30 min，于517 nm測定混合溶液的吸光值，以相同體積甲醇代替試樣，測定其吸光值作為空白對照。清除能力以mmol Trolox／100 g DW表示。

1.2.6 ABTS＋·的清除能力

清除 ABTS＋·能力試驗參照 Filipcˇev等[10]的方法并稍作修改，向5 mmoL／L ABTS溶液中加入二氧化錳，并在室溫下避光放置30 min后形成ABTS＋·儲備液，在734 nm波長下，用pH＝7.4的磷酸緩沖液稀釋ABTS＋·溶液至吸光度值為0.7±0.02。500 μL消化液與3 mL ABTS＋·混勻室溫下避光反應6 min在734 nm測定吸光度值，以Trolox作為標樣制作標準曲線，結果以mmol Trolox／100 g DW表示。

1.2.7 β-胡蘿卜素-亞油酸抗氧化體系

參照 Rebey等[11]的方法，并稍作修改。稱取β-胡蘿卜素2.0 mg、45 mg亞油酸及350 mg Tween-40，用氯仿將其定容到10 mL。取2 mL配好的溶液至圓底燒瓶中，45℃旋轉蒸干，100 mL蒸餾水溶解，劇烈震蕩30 min以達到氧飽和，形成乳化液。在試管中逐一加入500μL消化液，隨后加入3.6mL乳化液，同時設置空白調零管和對照管。抗氧化效果采用 AAC（antioxidant activity coefficient，抗氧化能力系數）來表示。

式中：As（60）為消化液在 t＝60 min時的吸光值；Ac（60）為空白在 t＝60 min時的吸光值；Ac（0）為空白在t＝0 min時的吸光值。

1.2.8 理論研究法

為了更好的理解消化過程中活性物質的生物利用率，定義了以下公式：

活性物質生物利用率（ACPX）＝cX／c0

注：cx為各消化吸收階段溶液活性物質的濃度（X＝1為口腔消化階段，X＝2為胃腸道消化階段，X＝3為小腸吸收階段），c0為有機溶劑提取的活性物質濃度。

1.2.9 統計方法

各組試驗數據均重復3次，所得結果用平均值±標準偏差表示。數據用Excel軟件繪制圖標，DPS軟件進行多重比較，檢驗的顯著水平為0.05。

2 結果分析

2.1 活性物質含量

2.1.1 黃酮含量

小麥、苦蕎饅頭和苦蕎芽粉饅頭各個階段的總黃酮的含量如表2所示。

表2 小麥、苦蕎原粉和苦蕎芽粉饅頭各階段消化液黃酮含量

由表2可以看出，隨著苦蕎芽粉含量的增加，饅頭消化液各個階段的總黃酮含量均顯著增加。

其中在胃腸道消化液中，芽粉饅頭總黃酮顯著高于同等比例添加量的苦蕎饅頭以及小麥饅頭。而在苦蕎芽粉饅頭的消化液中，總黃酮含量由高到低的順序依次為S2＞S3≈S1，即總黃酮濃度在胃腸道消化之后達到峰值，而在口腔中和吸收后濃度較低。

黃酮的生物利用率結果表明，盡管饅頭的甲醇提取液總黃酮含量很高，但在人體的消化環境中含量卻非常低，即食品中總黃酮的生物利用效率很低，能夠吸收的黃酮類物質更小。相對于對照組的小麥饅頭，在饅頭加入一定比例（4%～12%）的苦蕎芽粉可以明顯提高各階段消化液中黃酮類物質的釋放比率，其中胃腸道的消化液生物利用率最高，為3.51%～4.52%，約是小麥饅頭的3～4倍；同時黃酮的吸收比率也明顯改善，為1.29%～1.43%，是對照組苦蕎原粉饅頭的7～8倍。

2.1.2 總酚含量

小麥、苦蕎饅頭和苦蕎芽粉饅頭各個階段的總黃酮的含量如表3所示。

從表3中數據可以得到，隨著苦蕎芽粉含量的增加，饅頭的總酚含量呈現上升的趨勢，并且在口腔、胃腸道和吸收3個階段都顯著高于苦蕎饅頭和對照組饅頭的總酚含量。與總黃酮的結果類似，各添加量苦蕎芽粉饅頭的總酚含量在胃腸道消化之后達到最大值（3.74～4.65 mg GA／100 g），而能透過半透膜的酚類物質只占胃腸道的22%～28%。小麥饅頭和苦蕎饅頭的總酚含量在胃腸消化液中也達到峰值（3.07～4.21 mg GA／100 g），但吸收率僅為9%～22%。

表3 小麥、苦蕎原粉和苦蕎芽粉饅頭各階段消化液總酚含量

總酚的生物利用率結果與總黃酮一致，盡管饅頭的甲醇提取液總酚含量很高，但在人體的消化環境中含量卻非常低，即食品中總酚的生物利用效率極低，能夠吸收的多酚類物質極少。隨著苦蕎芽粉添加量的增加，雖然各階段消化液總酚的含量增加，但生物利用率卻呈下降的趨勢；當添加量達到8%時，饅頭總酚在口腔和胃腸道階段的生物利用率甚至小于小麥饅頭和相同比例添加量的苦蕎原粉饅頭。

2.2 饅頭消化液抗氧化能力測定

2.2.1 DPPH·清除能力

小麥、苦蕎饅頭和苦蕎芽粉饅頭消化3個階段的DPPH·清除能力如表4所示。

由表4可知，苦蕎芽粉饅頭各階段消化液清除DPPH·能力顯著高于苦蕎饅頭和小麥饅頭，并且隨著添加量的增加，清除自由基的能力逐漸增加，并且經過胃腸道消化的溶液抗氧化能力最強。當苦蕎芽粉的添加量達到12%，饅頭胃腸道的消化液清除DPPH·能力最強，為6.20mmol Trolox／100 g DW顯著高于相同苦蕎粉添加量饅頭胃腸道消化液的5.71 mmol Trolox／100 g DW，約是對照組的2.8倍。

2.2.2 ABTS＋·的清除能力

小麥、苦蕎饅頭和苦蕎芽粉饅頭3個階段的ABTS＋·的清除能力如表5所示。

由表5知，苦蕎芽粉饅頭各階段消化液清除ABTS＋·能力顯著高于苦蕎饅頭和小麥饅頭，且隨著添加量的增加，清除自由基的能力逐漸增加，胃腸道消化后抗氧化能力最強。當苦蕎芽粉的添加量達到12%，饅頭胃腸道的消化液清除ABTS＋·能力最強，分別為4.29 mmol Trolox／100 g DW，顯著高于相同苦蕎粉添加量饅頭胃腸道消化液4.16 mmol Trolox／100 g DW，約是對照組的1.8倍。

2.2.3 β-胡蘿卜素亞油酸漂白能力

小麥、苦蕎饅頭和苦蕎芽粉饅頭3個階段的β-胡蘿卜素亞油酸褪色能力如表6所示。

表4 小麥、苦蕎原粉和苦蕎芽粉饅頭各階段消化液清除DPPH·能力／mmol Trolox／100 g

表5 小麥、苦蕎原粉和苦蕎芽粉饅頭各階段消化液清除ABTS＋·能力／mmol Trolox／100 g

表6 小麥、苦蕎原粉和苦蕎芽粉饅頭各階段消化液抑制β-胡蘿卜素褪色能力

所有試驗的饅頭消化液中，小麥饅頭的抗氧化系數最低，抗油脂氧化的效果最差。苦蕎芽粉饅頭開始在唾液消化液中抑制β-胡蘿卜素褪色的能力較低，顯著弱于相同比例添加量的苦蕎原粉饅頭，但隨著消化過程的進行，苦蕎芽粉饅頭消化液抑制亞油酸漂白能力逐漸增強，胃腸道消化之后抗氧化系數達到最大，為142.26～178.78，顯著高于相同梯度的苦蕎原粉饅頭。在所有樣品消化吸收3個階段中，抗氧化效果由高到低依次為S2＞S3＞S1，苦蕎芽粉饅頭在吸收階段中抗氧化系數最低，僅為12.77～15.76。當苦蕎芽粉添加量為4%時，吸收液抑制β-胡蘿卜素褪色的能力雖然高于小麥，但與相同比例的苦蕎原粉饅頭相比無顯著性差異。

2.3 相關性分析

小麥、苦蕎原粉和苦蕎芽粉饅頭消化液總酚、總黃酮含量與DPPH·和ABTS＋·清除能力關系如表7所示。

表7 小麥、苦蕎原粉和苦蕎芽粉饅頭消化液總酚、總黃酮含量與抗氧化性的相關性

表7的數據顯示，小麥、苦蕎原粉和苦蕎芽粉饅頭各階段消化液總酚、總黃酮含量與 DPPH·和ABTS＋·清除能力呈正相關，其中總酚含量與消化液DPPH·和ABTS＋·清除能力呈極顯著相關，說明總酚的含量越高，消化液DPPH·和ABTS＋·清除能力越強。然而，消化液總酚和總黃酮含量與抑制β-胡蘿卜素褪色能力相關性并不顯著。說明雖然總酚和總黃酮對油脂氧化有一定阻遏作用，但它們在油脂體系中抗氧化的效果相對于其清除DPPH·和ABTS＋·效果稍顯不如。

3 討論與結論

人體內許多生化反應會伴隨著自由基的產生，數量過多會與體內脂肪酸、蛋白質等發生反應，破壞相關細胞的功能和結構，引發機體衰老，成為癌癥、動脈粥樣硬化等疾病的誘因[12]。DPPH·和ABTS＋·是穩定的有色人工自由基，被廣泛用于模擬人體自由基和食品抗氧化能力的測定。

苦蕎芽粉饅頭體外模擬消化后抗氧化性的研究表明，樣品經過消化吸收后仍然具有清除DPPH和ABTS自由基的能力，以及抑制β-胡蘿卜素褪色的能力，并且隨著芽粉添加量的增加，抗氧化性越強。苦蕎芽粉饅頭的黃酮和多酚含量、抗氧化能力均顯著高于相同比例苦蕎原粉饅頭和對照組的小麥饅頭，試驗結果與苦蕎芽的黃酮和多酚含量高于苦蕎種子結論一致[13]，說明可以通過向饅頭中添加富含活性物質的苦蕎芽粉來提高食品的營養和功能品質。同時，這些活性成分受到消化液和外部化學環境的影響后，會逐漸釋放出來，并在胃腸道消化之后達到最大。這是因為在食物的消化過程中，在一系列消化酶的作用下，植物細胞壁會發生破裂或者皺縮，使得儲存在細胞內的多酚類物質在消化過程中被緩慢的釋放出來[14]。酚類物質通常以糖苷配體或者酯的形式存在，經過胃液的酸性環境時，在較低pH值的作用下會水解釋放出大量的自由酚，使得樣品的總酚含量在胃腸液提取后顯著增加[15-16]。消化液中的活性物質在體內的吸收率卻不高，試驗結果與Tagliazucchi等[10]報道關于葡萄多酚的生物利用率以及Urszula等[16]報道的洋蔥面包體外模擬消化后多酚含量及清除DPPH自由基能力的變化規律是一致的[14，16]。有研究證明，結合態的酚類化合物進入腸道細胞是通過Na＋通道主動運輸的方式而自由態的酚類化合物則是通過被動運輸途徑[17]。試驗用透析袋模擬小腸的吸收過程沒有消耗能量，所以只包含被動運輸方式。苦蕎芽粉饅頭的黃酮和多酚吸收量顯著高于苦蕎饅頭和小麥饅頭，不僅是因為芽粉中的酚類化合物高于原粉，還可能是和芽粉中游離態的酚類物質組成較高有關。然而研究還發現，雖然饅頭多酚和黃酮類物質的含量非常高，但是這些活性物質的生物利用率非常低，因為人體消化液的基質是水，而黃酮和多酚類物質多是脂溶性的，所以盡管在酶和pH的作用下消化液的黃酮和酚類物質含量會增加，但人體可利用的活性物質含量較總體來說是極低的。并且，生物利用率會隨著苦蕎芽粉添加量的增大而減小，這可能是因為溶液中部分游離的黃酮和多酚會與被胰蛋白酶分解的多肽或纖維素結合，降低活性物質的生物利用率[7]。活性物質含量與其抗氧化性有良好的線性關系，其中總酚含量與DPPH·和ABTS＋·清除能力有極顯著的相關性，表明酚類物質在食品抗氧化性中起到了巨大的作用，所以由于酚類物質含量的不同，使得各階段的消化液表現出不同的抗氧化性。萌發是一個逆境生長過程，芽苗為了抵抗外部氧脅迫環境自身合成大量多酚和黃酮[18]，使得芽苗的抗逆性增大，苦蕎芽粉饅頭抗氧化活性增強。

研究認為，苦蕎芽粉可以開發為一種輔料添加到日常食用的饅頭當中，對氧化應激引起的慢性非傳染性疾病可能具有預防效果[19]。近年來，越來越多的研究證明雜糧中植物化學組分對由氧化應激引起的退行性疾病有很好的預防和治療作用[20]。研究表明，苦蕎富含酚酸和黃酮類化合物，這些活性成分具有防治高血壓、冠心病、糖尿病以及抗癌、抗腫瘤等多種功能[21]。然而目前大多關于食品抗氧化性的報道都是采用乙醇或者甲醇作為溶劑提取樣品中的活性成分，這樣體外測定的結果可能與人體胃腸液作為溶劑提取的效果差異很大[22]。模擬體內環境研究多酚和黃酮類物質的消化和吸收，所得的結果更貼近于真實的生理環境，并且對于探索食品中活性成分的有效濃度有重要的意義，同時為進一步的體內試驗提供參考。以上體外研究結果雖然揭示了苦蕎芽粉饅頭抗氧化能力變化規律的可能性，但是否與體內復雜生理環境下的變化特點保持一致，仍需今后動物實驗乃至人體觀察的進一步研究。

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