HPLC快速分析法測定三七總皂苷含量的研究

蘇家輝

（佛山市中醫(yī)院，廣東 佛山 528000）

HPLC快速分析法測定三七總皂苷含量的研究

蘇家輝

（佛山市中醫(yī)院，廣東 佛山 528000）

目的 研究采用HPLC快速分析法測定三七藥材中三七皂苷含量的方法。方法 以安捷倫ZORBAX Stable Bound（4.6 mm×50 mm，1.8 μm）色譜柱為固定相，0.2 %的磷酸溶液和甲醇（48/52）為流動相，檢測波長分別為三七皂昔R1在0.24～23.7 pg、人參皂昔Rgl在0.83～89.0 pg、人參皂昔Re在0.13～11.2 pg、人參皂昔Rb1在0.74～74.0 pg、人參皂昔Rd在0.21～18.3 pg。結(jié)果 檢測在1 min時，即出現(xiàn)基線分離，平均回收率分別為96.03 %、98.83 %、98.02 %、97.68 %和97.13 %，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.3 %、1.1 %、1.2 %、1.4 %和1.1 %。檢測時間節(jié)約與傳統(tǒng)方法相比節(jié)省了60 %左右的時間。結(jié)論 該方法簡便、快速、結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，為HPLC樣品的快速測定提供了依據(jù)。

HPLC快速分析法；三七總皂苷

三七是五加科人參屬植物，是較為名貴的中藥材之一，具有活血化瘀、消腫止痛的功效。三七臨床多用于治療心腦血管疾病、吐血、衄血、跌打損傷等疾病，其有效成分以人參皂苷Rg1、Re1、Rd以及三七皂苷R1等成分[1,2]。目前對與測定三七皂苷成分的方法有很多種，包括薄層掃描法、膠束電動毛細管電泳法、高效液相色譜法(HPLC法)等。按照《中國藥典》(2010年版)的要求，應(yīng)采用高效液相色譜法測定“三七”中人參皂苷和三七皂苷的含量。但是在臨床操作中發(fā)現(xiàn)，HPLC測定法常常存在分析時間長、消耗有機溶劑多的缺點。為了改善HPLC的測定技術(shù)，本課題采用HPLC快速分析法，對三七提取液中人參皂苷和三七皂苷的含量進行分析和常規(guī)方法比較大大縮短了分析時間，總結(jié)如下。

1 實驗部分

圖1 試驗品HPLC圖譜

1.1 主要儀器與設(shè)備

本研究采用美國Waters公司Alliance高效液相色譜儀，包括2690分離系統(tǒng)(四元泵、柱溫箱及自動進樣器)，996紫外二極管陣列檢測器，Millennium32色譜管理軟件。甲醇：高效液相色譜專用(Fisher公司生產(chǎn))。水為石英亞沸蒸餾水并用Milli2Q50(美國Millipore公司)超純水儀處理，電阻≥18 Ω/cm。

1.2 藥品

試驗藥：選擇三七藥材（云南白藥中藥飲片分公司），自制，經(jīng)HPLC測定其三七成分（三七皂苷R1，人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、Rb1、Rd1）。對照藥：來自于中國藥品生物制品檢定所提取。

1.3 試驗樣本的制備

三七提取液，自制，精密稱量0.2 g，置于50 mL的量瓶中，加入適量的70 %甲醇，采用超聲提取20 min，用70 %甲醇稀釋，用0.45 μm針頭過濾器過濾。

1.4 色譜條件

色譜柱為安捷倫ZORBAX Stable Bound（4.6 mm×50 mm，1.8 μm）色譜柱，流動相選擇甲醇-混合液（乙氰∶1 %醋酸∶0.4 %磷酸=30∶35∶35）；流速為1.0 mL/min，檢測波長為209 nm，柱溫：40 ℃，進樣量為20 μL。

按照上述的色譜條件對試驗品和對照品進行分析，分離效果較為理想。

2 結(jié) 果

2.1 線性關(guān)系結(jié)果

精密提取對照品溶液2、4、5、8、10、12 μL進行色譜測定，按照色譜條件進行峰面值測定。以峰面積與進樣量進行線性回歸，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線：三七皂苷R1 Y=294.31X-7.3424，r=0.9999，人參皂苷Rg1Y=257.3X＋23.45，r=0.9999，人參皂苷ReY=243.23X+2.54，r=0.9999，人參皂苷Rb1 Y=224.52X＋4.31，r=0.9999，人參皂苷RdY=253.59X＋3.67，r=0.9999。可見，三七皂昔RI在0.24～23.7 pg、人參皂昔Rgl在0.83～89.0 pg、人參皂昔Re在0.13～11.2 pg、人參皂昔Rb1在0.74～74.0 pg、人參皂昔Rd在0.21～18.3 pg的波長范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。詳見圖1、2。

2.2 精密度測試

采用精密吸取對照品溶液，10 μL，測試6次，其峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.3 %、1.1 %、1.2 %、1.4 %和1.1 %，提示儀器精密度良好。

2.3 穩(wěn)定性測試

取試驗品10 μL，分別于0、2、4、6、8 h進樣測定，其峰面面積積分值相對標(biāo)準(zhǔn)差分別為0.43 %、0.53 %、0.72 %、0.49 %和0.52 %，提示試驗樣品溶液在8 h內(nèi)比較穩(wěn)定。

圖2 對照品HPLC圖譜

2.4 重復(fù)性試驗

取三七提取液樣品，分別制備5份試驗樣品，按照上述色譜條件測定三七皂苷RSD分別為1.56 %、1.38 %、1.78 %、1.57 %、1.64 %。

2.5 加樣回收率試驗

取三七提取液樣品0.75 g精密加入一定量對照品，按照上述色譜條件測定含量，計算其回收率，結(jié)果三七皂苷R1，人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd的平均回收率分別為98.57 %、97.63 %、99.25 %、99.13 %、99.06 %，其RSD分別為1.64 %、1.09 %、1.53 %、1.49 %、1.63 %。

3 討 論

三七市我國特有的中藥材，基于三七有效成分研制的三七制劑，具有活血化瘀的功效，廣泛用于臨床治療，具有良好的社會效益和經(jīng)濟效益。而其質(zhì)量控制的方法學(xué)探索也一直是研究的熱點。近年來，國內(nèi)已有不少學(xué)者采用高效液相色譜法檢測三七及其制劑中皂苷類成分含量[3]，但絕大多數(shù)文獻僅檢測其中3種成分，同時測5種皂苷的報道很少；而且在方法上存在分析時間長（含平衡時間在90 min以上）、消耗有機溶劑多等缺點，雖然超高效液相（UHPLC）可以實現(xiàn)三七中多種皂苷的快速分離[4]，但由于設(shè)備昂貴，難以在短期內(nèi)普及。

實驗證明，采用HPLC快速測定法，三七總皂苷與人參總皂苷等成分均具有良好的分離度和線性關(guān)系，結(jié)果滿意。與現(xiàn)有文獻相比，本方法簡單快速，靈敏度高，結(jié)果重現(xiàn)性好，可用于三七及其制劑的質(zhì)量控制。尤其體現(xiàn)在試驗時間上，本方法能在10 min左右就能獲得待測成分與其他干擾成分良好的分離要求。在試驗中，其最高效率的時間相比其他文獻報道來說縮短了60 %[3]。從有機溶劑使用量相比可以比常規(guī)的分析方法節(jié)約3倍左右。

本文方法簡便、準(zhǔn)確，精密度和重復(fù)性較好，可用于三七藥材或其制劑的含量測定[4-6]，可以為以后的開發(fā)利用及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。

[1] 藥典委員會.中國藥典(一部)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2010:11.

[2] 毛春芹,陸兔林,葉定江.HPLC法測定三七不同飲片中人參皂苷Rg1含量[J].中成藥,2002,24(12):942-943.

[3] 蘇曉濤,李素霞.三七不同部位人參皂苷Rg1含量的比較[J].中國藥師,2007,10(2):183-184.

[4] 李俊松,陳軍.快速分離液相色譜法測定三七中3種皂苷的含量[J].醫(yī)藥導(dǎo)報,2009,28(12):1625-1626.

[5] 吳其國,符德歡,王麗.HPLC法測定姜狀三七根莖中的人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和三七皂苷R1[J].云南大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2012,34(2): 202-206.

[6] 張永昕,俞發(fā).HPLC法測定活血止痛片中三七皂苷R1、人參皂苷 Rg1、Re、Rb1含量[J].中藥材,2008,31(5):771-773.

R282.710.5

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：1671-8194（2014）04-0053-02