單子葉植物不同 Ppc基因構(gòu)建對煙草轉(zhuǎn)化幼苗生長的影響

張桂芳，丁在松，趙 明*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，農(nóng)業(yè)部作物生理生態(tài)重點實驗室，北京 100081；2.北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）編輯部，北京 100875）

單子葉植物不同 Ppc基因構(gòu)建對煙草轉(zhuǎn)化幼苗生長的影響

張桂芳1,2，丁在松1，趙 明1*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，農(nóng)業(yè)部作物生理生態(tài)重點實驗室，北京 100081；2.北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）編輯部，北京 100875）

為比較單子葉植物 2 種不同形式（cDNA 和 DNA）的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC）基因（Ppc）在雙子葉植物中的表達(dá)效果，本研究將單子葉植物稗草（Echinochloa crusgalli）Ppc 基因的 cDNA 和玉米（Zea mays）Ppc 基因的 DNA 全長通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)對雙子葉植物煙草（Nicotiana tabacum）進行了遺傳轉(zhuǎn)化。GUS 組織化學(xué)染色、PCR、RT-PCR 檢測結(jié)果表明，2 種形式的 Ppc 基因均轉(zhuǎn)入了煙草中；觀察分化幼苗生長發(fā)育過程發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn) Ppc基因 cDNA 的煙草分化苗生長發(fā)育正常，而轉(zhuǎn) Ppc 基因 DNA 的分化幼苗在培養(yǎng)過程中葉片白化現(xiàn)象嚴(yán)重，未完成正常生長發(fā)育過程，可能是由于完整基因DNA在異源細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄起始位點不正確或拼接錯誤而導(dǎo)致基因表達(dá)異常。由此推測在遺傳距離較遠(yuǎn)的物種間轉(zhuǎn)移 DNA 基因序列全長可能會降低正常表達(dá)率。凈光合速率（Pn）的測定結(jié)果表明，大部分轉(zhuǎn)稗草 Ppc基因煙草的Pn 高于對照，結(jié)果初步證明單子葉植物稗草的根型PEPC 酶對煙草的光合作用具有一定的調(diào)節(jié)作用。

稗草；玉米；煙草；磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶；凈光合速率；遺傳距離

磷 酸 烯 醇 式 丙 酮 酸 羧 化 酶 （ phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC）為催化磷酸烯醇式丙酮酸（PEP)與 HCO3-反應(yīng)生成草酰乙酸（OAA）呈不可逆反應(yīng)的酶，在 C4植物光合作用的 CO2固定反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。由于C4植物在高溫、干旱、強光和低濃度 CO2條件下能夠保持很高的凈光合速率，由此啟示學(xué)者們探索利用 C4途徑關(guān)鍵酶來優(yōu)化 C3植物的光合作用，以提高 C3植物的凈光合效率。大部分 C4植物屬于單子葉植物的禾本科或莎草科[1]，而 C3植物煙草（Nicotiana tabacum）屬于雙子葉植物茄科。由于煙草干物質(zhì)的 90%以上來自于葉片的光合作用，而煙草葉片又是整個植物體干物質(zhì)來源最重要的器官，因此，培育高光效煙草顯得尤為重要。目前，多數(shù)的研究集中于將單子葉禾本 科 栽 培 植 物 如 玉 米 （ Zea mays）[2-3]、 高 粱（Sorghum）[4]、甘蔗（Saccharum officinarum）[5]等的 C4型 PEPC 酶基因轉(zhuǎn)入單子葉禾本科 C3植物如水稻中（Oryza sativa），以改善水稻的光合效率。玉米、甘蔗等植物 C4光合關(guān)鍵酶基因?qū)煵莸霓D(zhuǎn)化也有報道[6-9]，但野生 C4植物稗草（Echinochloa crusgalli）的光合關(guān)鍵酶基因?qū)煵莸霓D(zhuǎn)化未見有報道。由于存在種系起源的遺傳距離，相對影響了單子葉植物 C4光合酶基因?qū)﹄p子葉植物的轉(zhuǎn)化效果[6,10]。本研究將稗草根型 Ppc 基因的 cDNA[11]和玉米 Ppc基因的完整DNA序列分別轉(zhuǎn)入了煙草中，用以比較研究 C4單子葉植物 Ppc 基因 cDNA、完整DNA 序列分別導(dǎo)入 C3雙子葉植物后的生理表現(xiàn)；期望獲得高水平表達(dá)C4植物PEPC酶的轉(zhuǎn)基因煙草株系，改善煙草的光合碳同化途徑，提高煙草葉片的產(chǎn)量與質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

烤煙品種 G140 由中國遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所贈送，北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院培養(yǎng)保存。限制性內(nèi)切酶、連接酶、聚合酶均購自 Takara 公司。抗生素類購自 Sigma。其他試劑均為分析純。含稗草根型 Ppc 基因 cDNA 的表達(dá)載體 pUbi-Eppc 由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所實驗室構(gòu)建[11]并保存，含玉米 Ppc 基因的 DNA 全長的表達(dá)載體 pCB-ZM Ppc由 Matsuoka 贈送。根癌農(nóng)桿菌 LBA4404、大腸桿菌 DH5α 及含有助動質(zhì)粒 pRK2013 的大腸桿菌HB101，均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所實驗室培養(yǎng)并保存。

1.2 根癌農(nóng)桿菌 LBA4404 轉(zhuǎn)化

采用三親雜交法將含目的基因的植物表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌 LBA4404 中。

1.3 煙草轉(zhuǎn)化

1.3.1 葉片消毒及預(yù)培養(yǎng) 選擇健康展開的煙草幼葉分別用 70%乙醇和 0.5%次氯酸鈉溶液消毒，然后制成葉盤，置入附加 6-BA 1mg/L、NAA 0.1 mg/L的 MS 平板上預(yù)培養(yǎng) 2 d。

1.3.2 轉(zhuǎn)化及共培養(yǎng) 將葉盤邊緣充分 浸 濕于LBA4404 菌液中感染數(shù)分鐘，轉(zhuǎn)入覆蓋有一層無菌濾紙的附加了 6-BA1mg/L 、吲哚乙酸（IAA ）0.1mg/L 的 MS 共培養(yǎng)基中于 25 ℃暗培養(yǎng) 2～3 d。1.3.3 光照繼代培養(yǎng) 當(dāng)共培養(yǎng)基上出現(xiàn)肉眼可見微小菌落時，將葉盤轉(zhuǎn)入MS繼代培養(yǎng)基（附加6-BA1mg/L、IAA 0.1 mg/L、頭孢霉素（Cef）500 mg/L）28 ℃，光下培養(yǎng) 3 d。

1.3.4 篩選及分化培養(yǎng) 將葉盤轉(zhuǎn)入 MS 篩選培養(yǎng)基（附加 6-BA1mg/L、IAA 0.1mg/L、Cef 500mg/L、Hyg 50 mg/L）培養(yǎng) 7～10 d，再轉(zhuǎn)入 MS 再生培養(yǎng)基（附加 6-BA1 mg/L、Cef 500 mg/L、Hyg 50 mg/L）。15～20 d 觀察到葉盤邊緣長出愈傷，1 個月左右轉(zhuǎn)接至新的再生培養(yǎng)基中，觀察愈傷產(chǎn)生分化苗過程，待分化出數(shù)片幼葉時，將幼苗轉(zhuǎn)入MS生根培養(yǎng)基（附加 Hyg 50 mg/L）中。生根后的幼苗在水中煉苗1周，然后移栽至花盆中培養(yǎng)。

1.4 轉(zhuǎn)基因煙草鑒定

1.4.1 GUS（β-葡萄糖苷酸酶基因）組織化學(xué)染色將帶有傷口還未分化的煙草葉盤及已分化出的無菌幼葉切出約 0.5 cm2大小的小塊放入新鮮 GUS 染色液[0.1mol/L 磷酸緩沖液（pH 7.0），50 mmol/L K3Fe (CN)6，50 mmol/L K4Fe (CN)6，0.5 mol/L Na2EDTA，1% Triton，20 mmol/L X-Gluc]中于 37 ℃恒溫條件處理 1～2 h 或溫育過夜，然后用 70%的乙醇脫色，直到組織色素去除干凈，顯微鏡下觀察染色情況。

1.4.2 PCR 及 RT-PCR 檢測 提取轉(zhuǎn)基因煙草葉片總 DNA，對目的 Ppc 基因用引物[11]P1C( 5'-ATC CGC AGA ACC CCT CCC ACT CCT CAA G -3')和 P2C( 5'-GGC GTT TCT CCT CCG ACC ACT CAG CAT A-3' )擴增。提取轉(zhuǎn)基因煙草葉片總RNA，以 Oligo-T17為引物進行反轉(zhuǎn)錄，然后繼續(xù)以P1C和 P2C為引物，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，進行 Ppc基因擴增。擴增后對目的基因片段回收并測序。

1.5 轉(zhuǎn)基因陽性植株培養(yǎng)

通過組織化學(xué)、PCR 和 RT-PCR 檢驗的陽性幼苗繼續(xù)進行生根、壯苗培養(yǎng)，最后移栽至大棚花盆。

1.6 葉片光合速率（Pn）測定

用 Licor-6400 型光合系統(tǒng)測定光合速率 Pn，設(shè)定光強為 1200 μmol/(m2·s1)、環(huán)境溫度為 28 ℃。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)基因煙草的轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)及分化生長過程

轉(zhuǎn)化后的葉盤（圖1a）經(jīng)共培養(yǎng)（暗培養(yǎng)）和繼代培養(yǎng)（光照培養(yǎng)）1周后進行篩選和分化培養(yǎng)，此過程中葉盤逐漸增厚增大，顏色變淺并脫分化在邊緣處產(chǎn)生愈傷組織。數(shù)周后在愈傷組織上可觀察到預(yù)分化黃綠色顆粒，將綠色待分化組織轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基上，28 ℃、光下培養(yǎng) 3～4 周后，開始分化出綠色小苗（圖1b，1c）。待小苗長至 4～5 片葉子時轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基上（圖1d），生根后的幼苗在水中煉苗 1 周（圖1e），然后移栽至花盆中培養(yǎng)（圖1f）。

2.2 轉(zhuǎn)基因煙草鑒定

轉(zhuǎn)化后挑選數(shù)枚帶傷口葉盤，經(jīng) GUS 染色液處理后在顯微鏡下全部能觀察到零星藍(lán)色斑點（圖2）出現(xiàn)，煉苗期間切取幼苗葉片進行 GUS染色和酒精脫色處理，結(jié)果顯示所有轉(zhuǎn)基因幼苗葉片均為顯示藍(lán)色沉淀的陽性植株。

圖1 煙草的轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)過程（a. 葉盤轉(zhuǎn)化；b、c. 轉(zhuǎn)化愈傷組織分化；d. 生根；e. 煉苗；f. 移栽花盆植株）Fig. 1 Tobacco leaf plate transformation and growth of regenerated plants. (a. leaf plate transformation; b, c. calli selection and regeneration; d. rooting; e. seedling; f. pot planting)

圖2 GUS 染色結(jié)果Fig. 2 The result of GUS staining

2.3 PCR 及 RT-PCR 檢測

葉片 DNA 樣品 PCR 擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖3a，顯示轉(zhuǎn)基因煙草均能擴增出稗草根型 0.8 kb 長度的 Ppc 基因片段（1～9 泳道），相應(yīng)非轉(zhuǎn)基因植株的擴增信號非常微弱（對照 1 和 2 泳道）；RT-PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖3b，顯示轉(zhuǎn)基因煙草樣品均擴增出的稗草 0.8 kb 長度的 Ppc 基因片段（1～7 泳道），相應(yīng)非轉(zhuǎn)基因植株（對照）幾乎無擴增信號。

選擇擴增信號較強的條帶切膠回收并測序，結(jié)果證明 0.8 kb 長度的 DNA 片段與所轉(zhuǎn)的目的 Ppc基因序列完全吻合，證明所轉(zhuǎn)目的基因在轉(zhuǎn)錄水平得到了表達(dá)。

2.4 轉(zhuǎn)稗草與轉(zhuǎn)玉米 Ppc 基因的煙草分化、生長發(fā)育過程對比

觀察轉(zhuǎn)稗草 Ppc-cDNA 和轉(zhuǎn)玉米 Ppc-DNA 煙草分化、生長發(fā)育情況發(fā)現(xiàn)，最初從愈傷中分化出的轉(zhuǎn)玉米 Ppc-DNA 與轉(zhuǎn)稗草 Ppc-cDNA 的煙草幼苗葉片均為鮮綠色，但在繼續(xù)生根培養(yǎng)過程中多數(shù)轉(zhuǎn)玉米 Ppc-DNA 苗的葉片逐漸由深綠變淺黃直至整個苗的葉片完全白化而停止生長（圖4a，4c），部分葉片扭曲成畸形，最后死亡；轉(zhuǎn)稗草 Ppc-cDNA的煙草幼苗除少部分出現(xiàn)白化現(xiàn)象外，大部分苗的葉片始終保持健康綠色（圖4b），完成了整個生長發(fā)育過程。

圖3 轉(zhuǎn)基因煙草及對照的 PCR(a)及 RT-PCR（b）電泳結(jié)果 (a. 泳道 1～9 為轉(zhuǎn)基因煙草葉片 DNA 擴增產(chǎn)物; b. 泳道 1～7為轉(zhuǎn)基因煙草葉片 RT-PCR 擴增產(chǎn)物； M 為 DNA 標(biāo)準(zhǔn)長度由上至下依次為 7500，5000，2500，1000，500 ，250bp)Fig 3. PCR and RT-PCR detection of Ppc gene in transgenic tobacco (a.Lane 1-9: DNA amplification products from transgenic tobacco leaves; b. Lane 1-7: RT-PCR amplification products from transgenic tobacco leaves; M: DNA markers, 7500，5000，2500，1000，500 bp.)

圖4 生根培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化苗（a、c. 轉(zhuǎn)玉米 Ppc DNA 幼苗葉片逐漸黃化；轉(zhuǎn)稗草 Ppc(b) c-DNA 幼苗正常生長）Fig. 4 Transformed seedlings from rooting culture (a, c. Tobacco seedlings transformed with maize Ppc DNA gradually turned yellow; b. Green and normally growing seedlings transformed with barnyardgrass Ppc )

2.5 轉(zhuǎn)稗草基因煙草凈光合速率

由于轉(zhuǎn)玉米Ppc基因的煙草幼苗最后夭折至盆栽期，沒有測得 Pn數(shù)據(jù)。測得了 7株生長良好的轉(zhuǎn)稗草 Ppc基因煙草成株期的 Pn 值，結(jié)果見表1。由表1 數(shù)據(jù)可知，7 株轉(zhuǎn)基因煙草中除 G140-Ecp4與 G140-Ecp7 這 2 株的 Pn 低于對照外，其他 5 株的 Pn 都高于對照，最高 1 株 G140-Ecp5 的 Pn[26.50 μmol/(m2·S)]高 出 對 照 [22.68 μmol/(m2·S)]的16.84%，另外 2 株（G140-Ecp3，G140-Ecp6）的Pn 也均高于對照的 10%以上。

此結(jié)果初步表明，單子葉植物稗草根型 PEPC酶對煙草的光合作用具有一定的調(diào)節(jié)作用。

表1 轉(zhuǎn) Eppc 基因煙草的 PnTable 1 Pn of transgenic tobacco plants

3 討 論

將單子葉 C4植物稗草的根型 Ppc 基因 cDNA和玉米 Ppc 基因 DNA 完整序列轉(zhuǎn)入遺傳距離較遠(yuǎn)的雙子葉 C3植物煙草中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)入 Ppc 基因cDNA 的煙草分化、生長能力較強，多數(shù)植株葉片Pn 高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ眨琍n 最高比對照提高了16.84%，但轉(zhuǎn)入 Ppc 基因 DNA 完整序列的煙草生長能力反而較差，分化出的幾株綠色幼苗在早期生根壯苗過程中葉片不斷有黃化現(xiàn)象發(fā)生，可能是由于葉組織細(xì)胞中的葉綠體在生長發(fā)育過程中破壞比較嚴(yán)重，葉片光合作用能力逐漸減弱，自養(yǎng)能力喪失，未能完成營養(yǎng)生長全過程，最后夭折。由于所轉(zhuǎn)玉米 Ppc基因 DNA 包含了玉米 Ppc 基因本身的啟動子、內(nèi)含子及終止子，推斷可能是由于玉米Ppc 基因的啟動子在煙草細(xì)胞中未能準(zhǔn)確識別轉(zhuǎn)錄起始或終止位點，也有可能發(fā)生錯誤的 m-RNA 拼接[12]而導(dǎo)致基因表達(dá)異常。而向單子葉作物水稻轉(zhuǎn)移完整的玉米 Ppc 基因 DNA，卻能得到高效表達(dá)PEPC 酶的轉(zhuǎn)基因水稻[13]，證明完整基因的內(nèi)含子在基因表達(dá)中的確起著重要作用。但在遺傳距離較遠(yuǎn)的物種間進行基因轉(zhuǎn)移，可能會降低完整基因DNA在異源植物細(xì)胞中的正常表達(dá)率，但不能排除正確轉(zhuǎn)化的可能性，需要加大轉(zhuǎn)化群體數(shù)量以選擇表達(dá)正常的轉(zhuǎn)基因植株。

本研究結(jié)果初步證實，在遺傳距離較遠(yuǎn)的物種間轉(zhuǎn)移基因的cDNA 序列，并選擇適應(yīng)范圍較寬的外源啟動子，可能會避免轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)生錯誤識別、拼接等問題。以往的轉(zhuǎn)基因研究中，很多植物表達(dá)載體的構(gòu)建選擇組成性表達(dá)的 CaMV 35S 啟動子[9,14-15]，該啟動子在雙子葉植物中能夠高效啟動表達(dá)。本研究轉(zhuǎn)入煙草的 Ppc 基因 cDNA，是由組成性表達(dá)的 Ubiquitin1 基因的啟動子 pUbi 啟動，pUbi啟動子的作用是 CaMV 35S 啟動子的 10 倍，我們已經(jīng)獲得到了正常表達(dá)稗草Ppc基因的轉(zhuǎn)基因煙草，且轉(zhuǎn)基因植株的光合效率得到了不同程度的提高，我們將進一步選育高水平表達(dá) C4植物 PEPC酶的煙草株系，以改善煙草的光合碳同化途徑，提高煙草葉片的生產(chǎn)力。

將稗草根型 Ppc基因 cDNA 轉(zhuǎn)入煙草，不僅對研究煙草在自然生長條件下光合生理特性的改變具有一定的意義，由于 PEPC 同工酶還參與植物其他代謝的調(diào)控過程[16-17]，PEPC 表達(dá)受抑制能夠改變代謝模式使碳原子的流向從糖類物質(zhì)的合成轉(zhuǎn)向脂肪酸的合成[18-19]。根型 PEPC 為非光合類型同工酶，能夠參與植物生長發(fā)育過程中許多其他功能，如根型 PEPC 同工酶活性的增加可增加番茄的氨同化能力[20]，我們還可進一步研究轉(zhuǎn)基因煙草在各種逆境條件（如高溫、高光強、干旱等）下的生長發(fā)育狀況，以確定根型 PEPC 同工酶在煙草中表達(dá)后執(zhí)行的具體功能。

4 結(jié) 論

單子葉 C4植物稗草根型 Ppc 基因的 cDNA 在組成性表達(dá)的 Ubiquitin1 基因的啟動子調(diào)控下，轉(zhuǎn)入遺傳距離較遠(yuǎn)的雙子葉植物煙草中，轉(zhuǎn)基因煙草的分化生長能力較強，得到了 Pn高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏霓D(zhuǎn)稗草根型 Ppc 基因的煙草；轉(zhuǎn)入玉米 Ppc 基因 DNA 完整序列的煙草生長能力反而較差，幼苗在早期容易發(fā)生黃化現(xiàn)象，葉片光合作用能力弱，可能是轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)生了錯誤識別、拼接等問題。導(dǎo)致基因表達(dá)異常，證明單子葉完整基因 DNA 在遺傳距離較遠(yuǎn)的雙子葉植物細(xì)胞中可能會降低正常表達(dá)率。

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Different Monocotyledonous of Ppc Genes on the Growth of Transformed Tobacco Seedlings

ZHANG Guifang1,2, Ding Zaisong1, ZHAO Ming1*
(1. Institute of Crop Science, CAAS, Key Laboratory of Crop Physiology and Ecology, MOA, Beijing 100081, China; 2. College of Life Science, Editorial Department of Journal of Beijing Normal University (Natural Science), Beijing 100875, China)

To compare two different forms (cDNA in monocotyledonous plants Echinochloa, DNA in monocotyledon Zea mays) of phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPC) gene (Ppc) on transformed dicotyledonous plant growth, the Ppc genes wereAgrobactirium-transfected into dicotyledon tobacco. Transformed leaf discs and differentiated seedling leaves were verified with GUS histochemistry, PCR, and RT-PCR. It was found that tobaccos transformed with barnyardgrass cDNA grew better than the complete maize DNA Ppc gene. The latter tobacco plants showed lower regeneration efficiency, leaves turned yellow and appeared wilted, possibly due to abnormal chloroplasts, or the complete maize Ppc gene was not expressed correctly in tobacco due to incorrect transcription initiation or incorrect splicing. Therefore to transfer DNA gene between genetically-distant species lower normal expression rate. Net photosynthetic rate (Pn) of transgenic tobacco plants transformed with barnyardgrass cDNA was higher than in untransformed tobacco, indicating that over-expressing Echinochloa root-Ppc gene improved tobacco photosynthesis.

baryardgrass; maize; tobacco; phosphoenolpyruvate carboxylase; net photosynthetic rate; genetic distance

S435.72

1007-5119（2014）06-0011-06

10.13496/j.issn.1007-5119.2014.06.003

張桂芳，博士，主要從事分子遺傳學(xué)研究。E-mail：zhangguifang@bnu.edu.cn。*通信作者，E-mail：zhaomingcau@vip.tom.com

2014-10-13