血管緊張素轉(zhuǎn)化酶結(jié)構(gòu)與功能的生物信息學(xué)分析

謝曉明邱芝青謝麗明雷 桅*

（1 廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東 湛江 524001；2 廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，廣東 湛江 524001）

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶結(jié)構(gòu)與功能的生物信息學(xué)分析

謝曉明1邱芝青2謝麗明2雷 桅1*

（1 廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東 湛江 524001；2 廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，廣東 湛江 524001）

目的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin converting enzyme，ACE，EC 3.4.15.1）是人類血壓控制系統(tǒng)的關(guān)鍵酶，其抑制劑也是廣泛應(yīng)用于臨床的降壓和心力衰竭治療一線藥物。方法本文采用Protparam等生物信息學(xué)方法和工具對(duì)ACE基因及其編碼蛋白的序列特征、分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)等進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析。結(jié)果表明該基因的核苷酸序列全長2473 bp，包括3'-UTR、ORF和5'-UTR序列，其蛋白分子式C3752H5724N1020O1086S26，含732個(gè)氨基酸殘基，以Leu含量最高，定位于分泌途徑，含跨膜結(jié)構(gòu)域，是一種含有21個(gè)堿基的質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽和Glu Zincin功能域的疏水性不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。其二級(jí)結(jié)構(gòu)和三維模型解析完成，結(jié)果顯示以隨機(jī)卷曲和α-螺旋為主。結(jié)論本研究可為深入開展人ACE蛋白的酶學(xué)特性和血流動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)機(jī)制研究提供理論參考。

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶；生物信息學(xué)；核酸；蛋白

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin converting enzyme，ACE，EC 3.4.15.1）是一種哺乳動(dòng)物組織中普遍存在的Zn2+依賴型羧二肽酶，為細(xì)胞膜上的整合單鏈糖蛋白，催化水解十肽血管緊張素Ⅰ羧基末端兩個(gè)氨基酸，生成具有血管收縮作用的八肽血管緊張素Ⅱ或水解具有血管收縮功能的緩激肽生成苯苯-精二肽，是高血壓、心肌梗死、心力衰竭等治療藥物篩選中的關(guān)鍵酶[1]。ACE在血壓調(diào)節(jié)機(jī)制中發(fā)揮重要作用，通過腎素-血管緊張素系統(tǒng)RAS（rennin-angiotensin system）和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)，對(duì)血壓、電解質(zhì)和體液平衡，以及心血管發(fā)育和結(jié)構(gòu)重塑等起關(guān)鍵調(diào)節(jié)功能，而且其抑制劑已經(jīng)作為高血壓的一線治療藥物成功應(yīng)用于臨床，如Captoril、Enalapril、Lisinopril等[2-4]。

ACE基因多態(tài)性被認(rèn)為與高血壓、心室肥厚、心肌梗死、糖尿病腎病等有顯著相關(guān)性，是多種心血管疾病的易感風(fēng)險(xiǎn)因子。該基因的多態(tài)性涉及3’端16號(hào)內(nèi)含子中287 bp位Alu重復(fù)序列的插入/缺失（I/D），與循環(huán)系統(tǒng)中的血漿ACE濃度相關(guān)，DD基因型的ACE酶活是II基因型的2倍，因此ACE基因型ID/DD與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展存在密切聯(lián)系[5,6]。本研究擬對(duì)人ACE基因及其相應(yīng)編碼蛋白的序列結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系和生化功能特征等進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和分析，以期在生物化學(xué)和分子生物學(xué)水平上進(jìn)一步研究人ACE蛋白的酶學(xué)特性和血壓調(diào)控機(jī)制研究提供理論依據(jù)。見圖1。

圖1 血管緊張素轉(zhuǎn)化酶及其抑制劑在RAS系統(tǒng)中的作用[7]

1 材料與方法

數(shù)據(jù)來源于NCBI核苷酸和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（GenBank）中已登錄的人ACE基因核苷酸序列及其對(duì)應(yīng)的氨基酸序列：ACE（Accession：M26657）。

利用Protparam、Vector NTI Suit 8、MEGA4.1、SignalP等軟件和www.ncbi.nlm.nih.gov、www.expasy.org等網(wǎng)站所提供的在線分析工具進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。核苷酸及氨基酸序列的分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)分析使用Protparam完成；ACE編碼核苷酸序列的開放閱讀框（ORF）搜尋、翻譯和同源性比對(duì)使用Vector NTI Suit 8軟件；基于ACE及其他物種的ACE氨基酸序列和MEGA4.1工具，使用Neighbor-Joining（NJ）方法構(gòu)建ACE蛋白的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹；通過TargetP 1.1 Server在線工具完成ACE蛋白的亞細(xì)胞定位，并對(duì)其結(jié)果進(jìn)行SignalP及ChloroP分析后得到ACE蛋白信號(hào)肽的相關(guān)信息；ACE蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域和疏水性分析分別使用TMHMM和ProtScale完成；ACE蛋白的功能結(jié)構(gòu)域和coiledcoil區(qū)分別用CDD和COLS分析；ACE蛋白的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與建模分別在GOR和SWISS-MODEL系統(tǒng)上計(jì)算獲得。

2 結(jié)果與分析

2.1 人ACE基因的核苷酸及相應(yīng)氨基酸序列的分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)分析。來自NCBI的人ACE核苷酸序列全長2473 bp，包括ORF（Open Reading Frame，開放閱讀框）、3'-UTR（Untranslated Regions，非翻譯區(qū)）和5'-UTR序列，其中ORF長2196 bp，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA。基于Protparam分析所得的ACE編碼蛋白的理化性質(zhì)[8]，該蛋白分子C3752H5724N1020O1086S26，相對(duì)分子質(zhì)量為83.3304 kDa，摩爾消光系數(shù)為156230，理論等電點(diǎn)pI＝6.13，脂肪系數(shù)81.19，半衰期為30 h，親水性平均系數(shù)（Grand average of hydropathicity，GRAVY）為-0.380，推測(cè)該蛋白表現(xiàn)疏水性，不穩(wěn)定系數(shù)為40.85，即屬不穩(wěn)定蛋白。人ACE編碼蛋白所含的氨基酸殘基數(shù)為732，其組成見表1，可知含Leu最多，且不含Pyl和Sec、Asx、Glx和Xaa。

表1 人ACE蛋白的氨基酸分布

2.2 人ACE蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域與亞細(xì)胞定位分析。利用TMHMM Server v. 2.0系統(tǒng)對(duì)人ACE蛋白的氨基酸序列進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)[9]，結(jié)果見圖2，人ACE存在1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，并且整條肽鏈橫跨于膜內(nèi)外，位于A682-A702。可見人ACE蛋白的催化功能不是在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中進(jìn)行，而是錨定于質(zhì)體，后經(jīng)過蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)，將血管緊張素Ⅰ送至特定部位，完成血管緊張素Ⅱ的生物合成和血管壓力的活性調(diào)節(jié)。

用TargetP 1.1 Server在線工具分析[10]顯示，人ACE蛋白定位于分泌途徑，屬分泌型蛋白。該蛋白含有21個(gè)氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)肽，預(yù)測(cè)可靠性等級(jí)為1。進(jìn)一步采用SignalP 3.0 Sever解析人ACE蛋白的氨基酸序列中信號(hào)肽區(qū)段及其所在位置[11]，發(fā)現(xiàn)其N端有21個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，剪切位點(diǎn)在21～22（分值為0.816）（圖3）。

圖2 人ACE蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

圖3 人ACE蛋白的信號(hào)肽預(yù)測(cè)

2.3 人ACE蛋白的保守功能域和coiled-coil結(jié)構(gòu)分析。蛋白質(zhì)由多個(gè)基序組成，且基序相應(yīng)的氨基酸區(qū)段行使特異的生化功能，同時(shí)也蘊(yùn)含著各自的遺傳進(jìn)化信息。利用CDD在線工具[12]分析人ACE氨基酸序列的功能結(jié)構(gòu)域，即去掉信號(hào)肽，剩下的成熟肽氨基酸序列包含一個(gè)Glu Zincin功能域（圖4）。表明人ACE編碼蛋白屬于Zn2+依賴酶超家族，而該基序則主要負(fù)責(zé)催化血管血壓調(diào)節(jié)過程中關(guān)鍵步驟——血管緊張素Ⅱ的生成。

圖4 人ACE蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析

2.4 人ACE蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分析。基于GOR4在線工具[13]預(yù)測(cè)人ACE氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果見圖5。在人ACE多肽鏈中，隨機(jī)卷曲占43.58%，α-螺旋占44.40%，延伸鏈占12.02%，可見隨機(jī)卷曲和α-螺旋是ACE多肽鏈中的主要結(jié)構(gòu)元件，延伸鏈散布于整個(gè)蛋白質(zhì)中。基于同源性的三維建模，將這條人ACE氨基酸序列上傳至SWISS-MODEL服務(wù)器中進(jìn)行自動(dòng)化模型生成，然后在ViewerLite 5.0軟件中進(jìn)行結(jié)構(gòu)編輯[14,15]，獲得ACE的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型（圖6）。

3 小 結(jié)

RAS系統(tǒng)在心腦血管系統(tǒng)的重要作用日益受到重視，其ACE的抑制劑也一直作為高血壓和心力衰竭治療的一線藥物。隨著人類對(duì)ACE結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制的深入研究，可能會(huì)產(chǎn)生新的更安全有效，且副作用更少和適應(yīng)性更強(qiáng)的ACE抑制劑。生物信息學(xué)是基于生物醫(yī)學(xué)臨床和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并與先進(jìn)計(jì)算技術(shù)和工具相結(jié)合的重要方法，已成為現(xiàn)代

圖5 人ACE基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖6 人ACE基因編碼蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

醫(yī)學(xué)研究的前沿領(lǐng)域。本文應(yīng)用生物信息學(xué)方法對(duì)人ACE基因的核苷酸及其編碼蛋白質(zhì)序列進(jìn)行了分析和建模，進(jìn)而對(duì)其分子結(jié)構(gòu)和生化性質(zhì)進(jìn)行了預(yù)測(cè)鑒定，結(jié)果表明人的ACE酶定位于分泌途徑，存在跨膜結(jié)構(gòu)域，是一種含有21個(gè)堿基的質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽和Glu Zincin功能域的不穩(wěn)定疏水性蛋白質(zhì)，二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)解析完成，以隨機(jī)卷曲和α-螺旋組分為主。本研究結(jié)果可為深入開展人ACE蛋白的酶學(xué)特性和血壓控制的分子機(jī)制研究提供重要理論參考，必將推動(dòng)ACE抑制劑及其候選藥物的研究開發(fā)和心血管醫(yī)學(xué)的基因治療。

[1] El-Sayedel SM,Abd-Ellah MF,Attia SM.Protective effect of captopril against Cisplatin-induced nephrotoxicity in rats [J].Pak J Pharm Sci,2008,21(3):255-261.

[2] Paul M,Poyan Mehr A,Kreutz R.Physiology of local reninangiotensin system[J].Physiol Rev,2006,86(3):747-803.

[3] Skidgel RA,Alhenc-Gelas F,Campbell WB.Relation of cardiovascular signaling by kinins and products of similar converning enzyme systems; prologue: kinins and related systems New life for old discoveries [J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2003,284(6):1886-1891.

[4] Vaidyanathan S,Jarugula V,Dieterich HA,et al.Clinical pharmacokinetics and pharmaco dynamics of aliskren [J].Clin Pharmacokinet,2008,47(8):515-531.

[5] Morshed M,Khan H,Akhteruzzaman S.Association between Angiotensin I-converting enzyme gene polymorphism and hypertension in selected individuals of the Bangladeshi population [J].J Biochem Mol Biol,2002,35(3):25-254.

[6] Agachan B,Isbir T,Yilmaz H,et al.Angiotensin converting enzyme I/D,Angiotensinogen T174M-M235T and angiotensin II type 1 receptor A1166C gene polymorphisms in Turkish hypertensive patients [J].Exp Mol Med,2003,35(6):545-549.

[7] 趙鈺嵐,許傳蓮.血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的結(jié)構(gòu)功能及相關(guān)抑制劑[J].生物工程學(xué)報(bào),2008,24(2):171-176.

[8] Gasteiger E,Hoogland C,Gattiker A,et al.Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server; (In) John M.Walker (ed):The Proteomics Protocols Handbook [M].Humana Press, 2005: 571-607.

[9] Ikeda M,Arai M,Lao DM.Transmembrane Topology Prediction Methods:A Reassessment and Improvement by a consensus method using a dataser of experimentally charaterized transmembrance topologies [J].In Silico Biol,2002,2(1):19-33.

[10] Emanuelsson O,Brunak S,von Heijne G,et al.Locating proteins in the cell using TargetP,SignalP and related tools [J].Nat Protoc ,2007,2(4):953-971.

[11] Petersen TN,Brunak S,von Heijne G,et al.SignalP 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions [J]. Nat Methods,2011,8(10):785-786.

[12] Marchler-Bauer A,Bryant SH.CD-Search: protein domain annotations on the fly [J].Nucleic Acids Res,2004,32(Web Server issue):327-331.

[13] Combet C,Blanchet C,Geourjon C,et al.NPS@: Network Protein Sequence Analysis [J].Trends Biochem Sci,2000,25(3):147-150.

[14] Arnold K,Bordoli L,Kopp J,et al. The SWISS-MODEL Workspace: A web-based environment for protein structure homology modelling [J].Bioinformatics,2006,22(2):195-201.

[15] Kiefer F,Arnold K,Künzli M,et al.The SWISS-MODEL Repository and associated resources [J].Nucleic Acids Res,2009,37(Database issue):D387-D392.

Bioinformatics Analysis of Angiotensin Converting Enzyme （ACE) Structure and Function of Human

XIE Xiao-ming1, QIU Zhi-qing2, XIE Li-ming2, LEI Wei1*
(1 Department of Vasculocardiology, the Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang 524000, China; 2 Department of Pharmacy, the Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang 524000, China)

ObjectiveAngiotensin converting enzyme (ACE, EC 3.4.15.1) is the key enzyme in human blood press control system, and its inhibitor has been used widely as the clinic first-line drug of antihypertensive and heart-failure treatment.MethodThe sequence characteristics, molecular structure and physicochemical properties of ACE gene and its coding protein were predicted and analyzed by bioinformatic methods and tools like Protparam.ResultsThe length of nucleotide acid sequence was 2473 bp, including 3'-UTR, ORF and 5'-UTR; the molecular formula of the ACE protein was C3752H5724N1020O1086S26 containing 732 aa, and Leu was the most abundant amino acid; ACE was anchored in the secretory pathway, with transmembrane domain, it was an unstable protein with a 21 aa plastidial transit-peptide. At last, its secondary and 3-D modelling was successfully established and it contained mainly alpha helix and random coil.ConclusionThis study can provide the theory references for the enzymatic properties and hemodynamics regulation mechanism of human ACE protein.

Angiotensin converting enzyme; Bioinformatics; Nucleic acid; Protein

R972.4

B

1671-8194（2014）34-0003-03

國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81300035）；廣東省自然科學(xué)基金（編號(hào)：S2013040012115）

*通訊作者：E-mail： thdmast@gmail.com