河南商品蛋雞群馬立克氏病病毒流行株的分離與鑒定

余祖華，丁 軻，滕 蔓，宿靖偉，羅 俊

（1.河南科技大學動物疫病與公共安全重點實驗室，河南洛陽 471003；2.河南省農業科學院a.農業部動物免疫學重點實驗室；b.河南省動物免疫學重點實驗室，河南鄭州 450002）

河南商品蛋雞群馬立克氏病病毒流行株的分離與鑒定

余祖華1，2a，2b，丁 軻1，滕 蔓2a，2b，宿靖偉2a，2b，羅 俊2a，2b

（1.河南科技大學動物疫病與公共安全重點實驗室，河南洛陽 471003；2.河南省農業科學院a.農業部動物免疫學重點實驗室；b.河南省動物免疫學重點實驗室，河南鄭州 450002）

2011年～2012年，河南省多個地區養殖場雞群爆發了馬立克氏病，應用外周血淋巴細胞培養分離技術對流行毒株分離并進行了PCR鑒定，最終分離到17個馬立克氏病毒毒株，這些病毒株感染雞胚成纖維細胞3～5 d后均能形成典型的病毒蝕斑，從感染細胞總DNA中均能擴增出132 bp重復序列的特異性條帶，且各毒株間132 bp重復序列擴增產物的拷貝數存在明顯差異，分離鑒定表明：河南雞群中可能存在不同毒力馬立克氏病毒野毒株的共流行。

馬立克氏病病毒；分離；鑒定；132 bp重復序列

0 引言

馬立克氏病（MD）是由馬立克氏病毒（MDV）感染雞引起的一種以淋巴細胞增生為特征的腫瘤性免疫抑制性傳染?。?］。MDV屬于α皰疹病毒，具有嚴格的細胞結合性［2－3］。MDV有3個血清型，血清型Ⅰ（MDV-1）、Ⅱ型（MDV-2）和Ⅲ型（MDV-3），其中，只有MDV-1具有致病性或致瘤性，包括對宿主具有毒力或致瘤性的強毒分離株以及它們的致弱變異株。根據致病性的不同，MDV-1野毒分離株又可以分為溫和MDV（m MDV）、強毒MDV（v MDV）、超強毒MDV（vv MDV）以及超超強毒MDV（vv＋MDV）［4－5］。MDV基因組全長約180 kb，主要由一個長獨特序列區（UL）和一個短獨特序列區（US）構成，在獨特序列區兩側分別是兩個序列完全相同的反轉重復序列區，長末端重復序列（TRL）和長內部重復序列（IRL）或是短末端重復序列（TRS）和短內部重復序列（IRS）［6－8］，MDV特異性的病毒基因主要位于反轉重復序列區TR／IR中［9］，其中，132 bp重復序列、meq基因和pp38基因等與MDV致腫瘤相關［10］。MD是一種可以用疫苗進行免疫預防的腫瘤性疾病，疫苗株主要有MDV-1的CVI988／Rispens株和國內的814株、MDV-2的SB1株及MDV-3的FC-126株，這些疫苗株在MDV的防控中發揮了重要的作用。雖然疫苗的應用能較好地預防MDV的發生，但由于MDV毒力在不斷的增強，近年來在國內外疫苗免疫雞群中仍不斷有MD的發生，給養雞業造成了嚴重的經濟損失［11－13］。2011年～2012年，中原地區較大面積的疫苗免疫雞群也發生了疑似MDV的病例［14］，本文從這些發病雞中分離了一些毒株，并通過對132 bp重復序列的PCR擴增進行了鑒定，發現河南省雞群中可能流行著不同毒力的MDV。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料：采集自河南省6地區MD疑似病例雞場［14］。

1.1.2 無特定病原體（SPF）雞胚：購于濟南斯帕法斯家禽有限公司。

1.1.3 毒株：GX0101 vv MDV株，由山東農業大學動物醫學院崔治中教授饋贈。

1.1.4 試劑：Premix Ex TaqTM、Universal Genom ic DNA Extraction Kit Ver.3.0，均購自寶生物工程（大連）有限公司。瓊脂糖凝膠回收試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.5 引物的設計與合成：根據GenBank中發表的MDV Md5株基因組序列（No.AF243438），用Primer primer5.0軟件設計了一對擴增132 bp重復序列引物，正向引物為P1：5’-ATGCGATGAAAGTGCTATGGAGGAA-3’，位于基因組129 048～129 072堿基處，反向引物為P2：5’-ATCGAAAGCGTTACCGAACTTGTCT-3’位于基因組129 371～129 395堿基處，設計的引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 雞胚成纖維細胞的制備：取孵化至9日齡的SPF雞胚，按常規方法制備單層雞胚成纖維細胞。

1.2.2 病毒的分離：從疑似發生MD的病例雞翼下采集1 mL抗凝血與9 mL含1%胎牛血清的DMEM培養基混勻，于1 000 r／mim離心5 min，將上層的白細胞混懸液接種到12孔板中長滿單層的CEF上，每樣3個重復，置CO2培養箱中于37℃培養5～6 d后，消化單層細胞盲傳至6孔板中長滿單層的CEF上，然后再盲傳至25 cm2細胞培養瓶中培養至病毒蝕斑出現。當培養細胞呈現典型的蝕斑后按照常規方法收集凍存細胞，于液氮中凍存。

1.2.3 病毒感染細胞總DNA的提?。喊凑誙niversal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0操作手冊提取細胞總DNA，NanoDrop ND-1000（NanoDrop公司，美國）測定提取的DNA的濃度及純度，并用去離子水將提取的DNA調整至濃度為100 ng／μL，于－20℃保存備用。

1.2.4 132 bp重復序列的PCR擴增：用提取的感染細胞總DNA為模板進行132 bp重復序列的PCR擴增，PCR反應體系為20μL，包括ExTaq酶10μL，10 pmol／μL的P1、P2各lμL，DNA模板1μL，ddH2O 7μL。PCR反應程序為94℃預變性4 m in，94℃變性1 min，62℃復性1 min，72℃延伸3 min，共30個循環，最后72℃延伸10 min后置4℃保存。PCR產物經2%（質量體積比）瓊脂糖凝膠電泳后在凝膠成像系統下分析電泳條帶。

圖1 MDV分離株在CEF上形成的蝕斑

2 結果

2.1 MDV分離培養結果

采集MD疑似病例雞的外周血，在CEF單層細胞上進行MDV的分離培養。經過3～8代的連續多次細胞盲傳代，從河南光山、上蔡、漯河、欒川、新鄭等地MDV疫苗免疫的產蛋雞群，約40份患病雞外周血樣本中共計獲得17個MDV分離株，分別命名為HNGS101、HNGS201、HNGS206、HNXZ101、HNXZ103、HNXZ106、HNLC107、HNLC202、HNLC203、HNLC401、HNLC502、HNLC503、HNLH302、HNLH303、HNLH304、HNLH305和HNSC105（見表1），分離率為42.5%。這些分離株在CEF上經過傳代培養后，均能較好的適應CEF，并在接種CEF細胞單層后3～5 d形成典型的病毒蝕斑（如圖1所示）。

表1 MDV河南分離株的部分背景信息

2.2 MDV132-bp重復序列的PCR擴增結果

對17個MDV分離株的132-bp重復序列進行PCR擴增，擴增結果發現：分離株HNGS101、HNXZ101、HNXZ103、HNXZ106、HNLC502、HNLH302、HNLH303、HNLH305和HNSC105與對照毒株GX0101一樣，均能擴增出與預期相符的2個132-bp拷貝大小的產物，分離株HNLC107、HNLC202、HNLC203和HNLC401擴增出與3個132-bp拷貝大小相符的PCR產物，從分離株HNGS206擴增出的132-bp產物約有4個拷貝，而分離株HNGS201、HNLC503和HNLH304的132 bp擴增產物至少含有7拷貝以上的132 bp重復序列（見圖2）。

圖2 132 bp重復序列PCR擴增產物

3 討論

MDV的分離，通常是將羽囊液上清經淋巴細胞分離液分離的外周血或脾臟的淋巴細胞接種至鴨胚成纖維細胞（DEF）或CEF上進行培養［13，15］，本研究直接將抗凝血低速離心去除紅細胞后將上層的白細胞混懸液接種至CEF上，也能分離出MDV，分離率高達42.5%，說明這種方法用于MDV的分離培養效果良好。132 bp重復序列是MDV-1所特有的基因序列，主要位于MDV基因組的長重復序列區。本研究分離的毒株應用132 bp基因的特異性引物均能擴增出特異性條帶，這表明分離的17株毒株均是MDV-1型毒株。本研究分離的MDV均來源于CVl988／Rispens株疫苗免疫雞群，這表明在中國中原地區也廣泛流行著MDV野毒株，且其致病力能突破疫苗免疫保護力，能造成雞群腫瘤發生。此前研究表明：132 bp的拷貝數可以作為初步判斷MDV非致瘤株、減毒株、弱毒株與強毒株的參考，毒力較強的MDV基因組中通常含有2～3個拷貝數的132 bp重復序列，而致弱毒株中則含有更高的拷貝數［16］。理論上而言，用設計的132 bp重復序列特異性引物擴增后，2拷貝的132 bp產物預計大小為348 bp，3拷貝的132 bp產物大小為480 bp，依此類推，7拷貝132 bp產物大小為1 008 bp。本研究中，分離株HNGS101、HNXZ101、HNXZ103、HNXZ106、HNLC502、HNLH302、HNLH303、HNLH305和HNSC105的132 bp重復序列拷貝數與分離自廣西雞群的vv MDV毒株GX0101的拷貝數相同，均為2個拷貝，而分離株HNLC107、HNLC202、HNLC203和HNLC401含有3個拷貝的132 bp重復序列，表明這些毒株可能是強毒株。MDV在細胞培養中連續傳代會增加132 bp重復序列的拷貝數［17］。文獻［18］研究表明：當MDV在細胞培養物中連續傳代75代后132 bp重復序列的拷貝數明顯增加到10個拷貝以上，這表明伴隨著MDV的毒力減弱132 bp重復序列的拷貝數會明顯增加。本文分離的HNGS201、HNLC503和HNLH304至少含有7拷貝的132 bp重復序列，但這些毒株的分離僅僅經歷了3～4代，表明這幾個分離株的132 bp重復序列的拷貝數不是由于連續傳代所致，可能這些分離株本身就屬于弱毒分離株或疫苗株，因此，這些分離株的確切毒力或致病性還有待進一步研究。

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S852.65；Q78

A

1672－6871（2014）01－0067－04

國家自然科學基金面上項目（31072145，31372445）

余祖華（1977－），女，河南商城人，講師，博士，主要從事動物傳染病與免疫學研究.

2013－09－11