重組腺病毒載體pDCpDC316316-hIL
--hIL-2424的構建及病毒滴度測定

李書華，陳婷婷，劉諭昆，李灝，陳藝瑛，張雅潔

臨床研究

重組腺病毒載體pDCpDC316316-hIL
--hIL-2424的構建及病毒滴度測定

李書華，陳婷婷，劉諭昆，李灝，陳藝瑛，張雅潔

廣州醫科大學，廣東廣州510182

目的構建重組腺病毒載體pDC316-hIL-24，并測定病毒滴度。方法從HEK293細胞中提取mRNA，設計特異性引物，通過RT-PCR法擴增hIL-24基因全編碼區序列。將測序正確的片段用BglⅡ和HindⅢ雙酶切定向插入到pDC316-EGFP穿梭質粒中。構建重組穿梭質粒pDC316-EGFP-hIL-24，在脂質體介導下與腺病毒輔助大質粒pBHGlox（delta）E1，3Cre共轉染293細胞，包裝產生復制缺陷型重組腺病毒pDC316-hIL-24，經HEK293細胞擴增，TCID50法測定重組腺病毒滴度。結果成功構建出表達hIL-24基因的重組腺病毒載體（pDC316-hIL-24），獲得了高滴度表達hIL-24基因的重組腺病毒。結論重組腺病毒表達載體（pDC315-hIL-24）的成功構建及重組腺病毒的獲得有利于進一步開展腫瘤的轉基因治療研究。

hIL-24；重組腺病毒載體；病毒滴度；pDC316-hIL-24

hIL-24是由哥倫比亞大學Jiang等［1］于1995年從人黑色素瘤細胞HO-1中分離獲得的一種新基因，現在又命名為黑色素瘤分化相關基因-7（mda-7）。近年來的研究發現該基因還能促進其他多種癌細胞的生長抑制，如卵巢癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、膠質瘤、胰腺癌等，并可抑制血管生成、誘導腫瘤細胞凋亡。相對于其它抗腫瘤基因，hIL-24是唯一的具有殺死腫瘤細胞而對正常細胞沒有任何毒性作用的細胞因子［2-5］，從而具有極大的臨床抗腫瘤應用價值。

AdMax包裝系統是由Frank教授建立的重組腺病毒表達載體，通過AdMax包裝系統構建重組腺病毒，具有操作簡便、重組效率高、獲得的病毒產率高而且目的基因的表達水平高等特點，因而已逐漸代替目前最普及的AdEasy系統。本實驗通過構建含人hIL-24基因的重組腺病毒pDC316-hIL-24表達載體，擴增表達hIL-24基因的重組腺病毒，通過感染腫瘤細胞并大量表達hIL-24蛋白，為進一步觀察hIL-24基因抗腫瘤作用奠定基礎

1 材料和方法

1.1 腺病毒和細胞株

AdMax重組腺病毒載體系統［包括穿梭質粒pDC316-EGFP以及E1、E3區缺失的5型腺病毒輔助大質粒pBHG loxΔE1，3Cre］購自加拿大Microbix。HEK293細胞及A549肺腺癌細胞株購為廣州醫科大學病理教研室保存質粒，PMD-18-T購自TAKARA。

1.2 主要試劑

低相對分子質量蛋白標準購自Takara威佳生物工程公司，限制性內切酶HindⅢ和BglⅡ快速連接試劑盒（DNA ligation kit）購于New England Biolabs；質粒小樣提取試劑盒（QIAprep MiniprepSystem）、膠回收試劑盒（QIAquick Gel Extraction）及PolyFect Transfection Reagent為Qiagen的產品；1640培養基、DMEM培養基及胎牛血清均為美國Gibco產品。

1.2.1 HEK293細胞培養及總RNA的提取采用DMEM培養液及10％FBS常規培養HEK293細胞，每2 d換液傳代。取1×106/ml對數生長期的HEK293細胞提取總RNA，按TRIZOL RNA提取試劑盒說明書進行操作。

1.2.2 逆轉錄cDNA第一鏈合成取RNA 1 μg，Oligo DT 1 μg，然后加入10×RAV-2 Reverse Transcriptaseuffer 2 μl，l RNase inhibitor 1 μl，10 mmol/L dNTP 2 μl，AMV逆轉錄酶1 L，l和DEPCH2O 5.4 Ll。反應總體積為20 μl，l混勻放置于30℃10 min，50℃30 min，99℃5 min，5℃5 min，最后于-20℃保存備用。

1.2.3 PCR擴增hIL-24基因全編碼區(cDNA)序列參考GenBank NM006850序列設計引物，引物含hIL-24基因全編碼區。上游引物：5'-CG AGATCTATGAATTT'TCAACAGAGGCTG-3'下游引物：5'-CCC GGATCCTTATCAGAGCTTTAGAATT-3'。引物由廣州瑞真生物工程公司合成。上下游引物兩端分別加有BglⅡ和HindⅢ酶切位點，擴增片段大小為621 bp，包含完整的IL-24基因cDNA。PCR反應條件為：95℃預變性3 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，30個循環，72℃延伸10 min。1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收目的片段。

1.2.4 hIL-2基因序列測定及酶切鑒定將hIL-24基因用T4Ligase連接于PMD18-T載體上，轉化TG1感受態細菌，用X-gal和IPTG進行藍白篩選，挑選白色陽性克隆搖菌，抽提質粒，雙酶切鑒定后送測序。

1.2.5 重組pDC316-EGFP-IL-4腺病毒載體的構建用BglⅡ和HindⅢ內切酶同時對腺病毒載體pDC316-EGFP和hIL-24片段進行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收；將回收的載體片段和目的基因cDNA用T4Ligase 16℃連接過夜，直接取5 μl連接產物轉化TG1感受態細菌，用含氨芐青霉素LB培養基平板進行篩選，挑出3個克隆，搖菌過夜，抽提質粒、雙酶切鑒定正確的重組腺病毒載體命名為pDC316-EGFP-hIL-24。

1.2.6 重組腺病毒pDC316-hIL-24的包裝用質粒抽提試劑盒提取病毒包裝系統中的質粒DNA，以紫外光吸收法測定其濃度及純度后進行質粒轉染過程［6-10］。將穿梭質粒pDC316-EGFP-hIL-4和輔助質粒pBHGlox （delta）E1，3Cre通過Lipofectamine2000共轉染HEK293細胞，觀察細胞生長狀況，待大部分細胞出現細胞病變(cytopathic effect,CPE)，收集細胞，-70℃/ 37℃反復凍融，收集病毒上清-70℃保存。

1.2.7 重組腺病毒pDC315-hIL-24的擴增、純化將生長狀態良好的HEK293細胞4倍稀釋后轉入細胞培養瓶中，加入重組腺病毒pDC315-hIL-24收獲的粗提液繼續培養，待大部分細胞出現典型的CPE，收集病毒上清液，再次擴增，將混懸液3000 r/min離心10 min，棄上清，細胞沉淀用Tris緩沖液重懸，反復凍融3次，6000 r/min離心，取上清，用DNase酶消化后，用0.45 μm的濾膜過濾，然后進行柱純化，-70℃保存。

1.2.8 重組腺病毒pDC315-hIL-24感染性滴度（TCID50）測定在離心管中將病毒液作連續10倍的稀釋，從10-1~10-10。將稀釋好的病毒接種到96孔微量培養板中，每一稀釋度接種一縱排共8孔，每孔接種100μl。在每孔加入細胞懸液100μl，使細胞量達到3×105/ml。將96孔板置于37℃CO2培養箱中培養，10 d后觀察細胞病變現象，并對CPE孔進行計數，計算每行的陽性率。病毒滴度計算按（Karber法）：滴度T＝101+d（s-0.5）進行。

2 結果

2.1 RT-PCR擴增hIL-24基因cDNA及序列測定

RT-PCR擴增hIL-24基因cDNA片段，用1％瓊脂糖凝膠電泳觀察，在621 bp處可見目的基因片段（圖1），擴增出的片段與預計目的片段大小一致。將回收的目的片段連接到PMD18-T載體，測序結果進一步證實克隆的序列完全正確（圖2）。

圖1 RT-PCR產物電泳圖Fig.1 Identification the hIL-24 gene by PCR, 1:hIL-24；2:DNAMARKER

2.2 重組腺病毒穿梭質粒pDC316-EGFP-hIL-24的酶切鑒定

構建出的pDC316-EGFP-hIL-24重組質粒用HinglⅡ和HindⅢ雙酶切，1％瓊脂糖凝膠電泳觀察，發現在621 bp和3.9 kb處分別可見目的基因和載體條帶，表明hIL-24基因已正確構建到腺病毒穿梭質粒中，見圖3。

圖2 PMD18-T-hIL-24測序結果Fig.2 Sequence of PMD18-T-hIL-24 DNAdectection.

圖3 pDC316-EGFP-hIL-24質粒經BglⅡ及HindⅢ雙酶切Fig.3Identification the pDC316-EGFP-hIL-24 byBglII andHindIII enzyme.1:pDC316-EGFP-hIL-24,2:DNAMarker.

2.3 重組腺病毒的構建

線性化重組穿梭質粒與輔助質粒pBHGlox（delta） E1，3Cre共轉染HEK293A細胞后，在倒置顯微鏡下觀察，可見轉染后的細胞出現細胞病變效應（CPE）：明顯增大、呈球形，細胞核變大，變圓，貼壁能力下降而易脫落。第7天出現明顯病毒噬斑（圖4），提示腺病毒構建成功并在HEK293細胞內復制。

圖4 出現CPE反應的293細胞Fig.4 293 Cells with a CPE response(Original magnification:×10).

2.4 重組腺病毒的鑒定

通過凍融法裂解細胞后，收取病毒液并感染HEK293細胞72 h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察熒光，發生同源重組的病毒，可見報告基因綠色熒光蛋白（GFP）的表達（圖5），提示重組腺病毒感染細胞并HEK293細胞內進行了表達。收取病毒液進行PCR鑒定結果顯示：取病毒DNA1 μl為模板，通過PCR方法擴增出約621 bp的特異性片段，其大小與陽性對照相符，表明mda-7/IL-24基因已克隆入重組腺病毒（圖6，7）。

圖5 pDC316 hIL-24的表達的綠色熒光蛋白Fig.5 Identification of gfp(O riginal magnification:×100).

圖6 Ad.mda-7.egfp的PCR鑒定Fig.6 identification of Ad.mda-7.egfp by PCR M:DNAMarker 2000;1:PCR positive.

圖7 Ad.IL-24.egfp圖譜Fig.7 Plasmid map of Ad.IL-24.egfp.

2.5 重組腺病毒滴度測定

收集產生感染性重組病毒顆粒的HEK293細胞，在37℃/-80℃條件下反復凍融3次，離心沉淀后，取部分病毒上清再次感染HEK293細胞以擴增重組病毒。如此反復進行多次可獲得高滴度的重組腺病毒。TCID50法測定所得病毒滴度為2.5×1010U/ml。

3 討論

白細胞介素24（hIL-24）是近年來發現的一種新型腫瘤抑制基因，現在又命名為黑色素瘤分化相關基因-7 （mda-7）。近年來的研究發現該基因還能促進其他多種癌細胞的生長抑制和凋亡，如卵巢癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、膠質瘤、胰腺癌等。相對于其它抗腫瘤基因，hIL-24在抗瘤抑瘤及降低毒副作面用兩具有明顯的優勢。首先，hIL-24的抗腫瘤具備惡性腫瘤選擇性。該基因對正常表皮細胞，肺成纖維細胞，乳腺細胞，前列腺和肺上皮細胞，星形膠質細胞，內皮細胞及黑色素細胞等正常細胞均無任何毒副作用；其次，hIL-24用于癌癥治療不受腫瘤細胞的抑癌基因狀態的影響，相對于p53等抑癌基因來說，hIL-24抑制癌細胞的增長和促進凋亡與這些癌細胞中其它抑癌基因的狀態無關(p53，Rb，或pl6ink4)，因而可以更穩定地發揮抗腫瘤作用；同時，hIL-24是一個前Thl因子(pro-Thlcytokine)，能激活STAI產生腫瘤免疫，抗血管生成和受體介導的細胞毒性［6-8］；最后，hIL-24蛋白還可以大大增強腫瘤細胞對放射治療的敏感性，從而起到殺傷腫瘤細胞的效果。hIL-24是IL-10家族中唯一的具有殺死腫瘤細胞而對正常細胞沒有任何毒性作用的細胞因子［2-4］，從而具有極大的臨床抗腫瘤應用價值。

本實驗采用的pDC316載體屬于腺病毒AdMax，構建重組腺病毒表達載體代替最普及的AdEasy系統。AdMax包裝系統是由Frank教授建立，由加拿大Microbix公司經銷。與目前使用最普及的腺病毒AdEasy系統相比，腺病毒AdMaxTM系統具有操作簡便、重組效率高、獲得的病毒產率高（一般大于104 vp/ cell）、目的基因的表達水平高（因為mCMV啟動子比hCMV啟動子強若干倍）等優勢［9-10］。AdMax系統只需要2~4周就能完成從質粒構建到重組出毒，AdMax系統因在真核細胞內重組出毒，出毒成功率大于98％（其中95％的克隆含有目的基因），而AdEasy系統的出毒成功率只有18％~34％［11］。我們將重組的含有目的基因hIL-24片段的穿梭質粒載體pDC316-hIL-24和骨架質粒pBHGloxΔE1，3Cre，共同轉染至HEK293細胞，包裝產生重組腺病毒pDC316-hIL-24，病毒活性單位為2.5× 1010U/ml，而常用的AdEasy包裝系統產生的病毒活性單位通常只有107~108U/ml，AdMax系統包裝的病毒活性顯然高于AdEasy包裝系統。本研究構建的腺病毒pDC316-hIL-24為進一步開展hIL-24基因功能的深入研究和重組腺病毒轉基因治療打下基礎。

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Construct ion of recombinant adenovirus vector pDC316-hIL-24 and the detection of viral titer

LI Shuhua,CHEN Tingting,LIU Yukun,LI Hao,CHENG Yiying,ZHANG Yajie Guangzhou Medical University,Guangzhou 510182,China

ObjectiveTo onstruct recombinant adenovirus vector pDC316-hIL-24 and detect the viral titer.MethodsTotal mRNA was ex tracted from HEK293 cells,and specific primer pairs were designed in order to clone human interleukin-24(hIL-24)gene cDNA by RT-PCR method.hIL-24 gene was directional constructed into shuttle plasmidr(pDC316-EGFP)after digestion by restrictive endoenzymeBglII,andHindIII.HEK293 cells were co-transfected with the constructed recombinant shuttle plasmid pDC316-EGFP and large adenovirus helper plasmid pBHGlox(delta)E1，3Cre in mediation of liposome。The constructed recombinant adenovirus vector was named pDC316-hIL-24.Recombinant adenovirus was amplificated and purificated in HEK293 ce lls.ResultsRecombinant adenovirus vector pDC316-hIL-24 was constructed successfully and high titer recombinant adenovirus was obtained.ConclusionThe construction of recombinant adenovirus vector pDC316-hIL-24 and the obtain of recombinant adenovirus will lay down the basis for developing gene therapy of cancer.

hIL-24;recombinant adenovirus vector;viral titer;pDC316-hIL-24

2014-04-19

廣東省醫學科研基金項目（A2013244）；教育部博士點基金項目博導類課題（20134423110001）；廣東省自然科學基金項目（S2012010010181）；廣州市科技計劃項目（2014Y2-00171）；廣州市教育系統創新學術團隊項目（13C06）

李書華，博士，講師，主要從事腫瘤生物治療研究

張雅潔，博士，教授，博士生導師，E-mail:yajie.zhang@163.com