Alzheimereimer患者血清中含有低水平及低親和力的抗A Aβ 自身抗體

段金海，徐書雯，莫建偉，肖豪，莫思杰，胡濤

臨床研究

Alzheimereimer患者血清中含有低水平及低親和力的抗A Aβ 自身抗體

段金海1，徐書雯1，莫建偉1，肖豪1，莫思杰2，胡濤2

1廣東省人民醫院神經內科//廣東省醫學科學院//廣東省老年醫學研究所//廣東省神經科學研所，廣東廣州510080；2廣東省南海福利中心，廣東佛山528226

目的研究AD病人血清中Aβ自身抗體的特性及對老年斑的親和力。方法選擇AD、血管性癡呆（vascular dementia,VD）患者及正常老年人做為研究對象，采集血清標本，測定抗體含量，并親和純化抗體進行免疫組化染色。結果AD患者血清中含有低水平的Aβ自身抗體，但抗體含量與性別、年齡和MMSE評分沒有相關性；AD體內的抗體不能識別Tg2576鼠腦內的老年斑。結論Aβ自身抗體的降低是AD病人特有的免疫低反應性所致；Aβ自身抗體與老年斑的親和力明顯降低；這些抗體的病理生理作用需要進一步研究。

阿爾茨海默病；血管性癡呆；抗Aβ自身抗體

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease,AD）是以進行性加重的記憶認知功能減退為主要臨床特點的中樞神經系統退行性疾病，主要病理特征為老年斑（senile plaques,SPs）及神經元纖維纏結（neurofibrillary tangles,NFTs）。β-淀粉樣蛋白（amyloid β-peptide,Aβ）具有神經毒性，其在腦內的生成增多及異常聚集是AD發病的關鍵因素。研究認為Aβ在體內可以誘導出抗Aβ自身抗體，因為從靜脈用免疫球蛋白可以分離出抗Aβ自身抗體［1］，并且可從人類B細胞克隆出Aβ抗體［2］。流行病學調查也發現，與正常人相比AD患者的血清和腦脊液含有低滴度的Aβ自身抗體［3］。但是這些自身抗體的病理生理作用仍然不清楚。在AD轉基因鼠和Ⅰ期臨床試驗中，Aβ1-42疫苗可以誘導出特異性的Aβ抗體，并顯示出良好的免疫原性和安全性［4］，但在Ⅱa期臨床試驗（AN1792）中，6％的受試者出現了無菌性腦膜腦炎［5］。目前認為，腦炎的發生與Aβ1-42全肽及佐劑QS21'導致的Th1'細胞免疫反應有關［6］。因此，在把免疫療法做為AD的預防和治療措施之前，有必要對AD患者體內的Aβ自身抗體進行細致的研究。本課題試圖分析AD患者抗Aβ自身抗體的特性并在體外觀察抗體與老年斑的接合能力。

1 材料和方法

1.1 受試對象

從2004年4月~2013年9月，選取廣東省南海福利中心、廣東省人民醫院、廣州市老人院以及中山大學附屬第一醫院的住院的AD、血管性癡呆（vasculardementia,VD）患者及正常老年人（healthy controls, HC）做為研究對象。AD入組標準:（1）符合美國國立神經病學傳染病及中風研究所與阿爾茨海默病和相關病協會（NINCDS-ADRDA）的診斷標準；（2）Loeb改良缺血量表評分均小于4分；（3）排除其他原因所致癡呆；（4）患者視、聽力及精神狀態允許合作完成神經心理學測試。VD入組標準：（1）患有腦梗死或腦出血病并經腦CT或MRI確診；（2）癡呆，符合美國精神病學會的《精神障礙診斷及統計手冊》第四版修訂版(DSM-Ⅳ-R) VD的診斷標準；（3）卒中3個月后發生癡呆，病程超過3個月，且認知功能呈突然或階梯性下降（4）Hachiski評分≥7分；（5）排除失語及卒中前有認知功能障礙者。正常對照組系普外科及骨科非神經系統疾病者，沒有記憶認知功能下降病史及澘在影響記憶認知功能的疾病。研究對象的臨床特征見表1。

1.2 方法

1.2.1 血清標本的收集和處理清晨空腹采血，裝入無菌試管，不加抗凝劑，室溫靜置30 min后，1000 g，4℃，離心10 min。上清分裝入另外一支無菌管，－70℃保存。

1.2.2 ELISA采用間接ELISA法檢測，Aβ42濃度（10 μg/孔）包被96孔聚苯乙烯反應板（Greiner公司），每孔100μl，4℃孵育過夜。3％小牛血清37℃封閉2 h。加入倍比稀釋的血清樣品（從1∶10開始稀釋）。過氧化物酶標記山羊抗人IgG（武漢博士德公司），1∶2 000稀釋，每孔100 ml，37℃孵育40 min，洗滌。TMB顯色，2M H2SO450 ml中止，于波長450 nm下測定每孔A值，以樣本孔吸收值比空白孔吸收值之比大于2.1為陽性。單克隆抗體8G7（Calbiochem,USA）作為陽性對照，建立標準曲線。

1.2.3 抗體純化33％和50％飽和硫酸銨鹽析：按常規方法進行［7］。溴化氰(CNBr)活化的Sephrose 4B柱層析：按試劑說明書操作，即取1.5 g CNBr-activated Sephrose 4B凍干粉，溶脹、重懸后，與4 mg的Aβ42蛋白混合,封閉、洗滌后裝柱。以50 ml PBS（pH 7.4）平衡柱（流速，60 ml/h），加入鹽析的粗提的IgG，用洗脫液（50 mmol/L HCl-甘氨酸緩沖液，pH分別為2.5和1.5交替進行）洗脫，出峰時收集流出的組分，用碳酸鹽緩沖液調節pH至中性，透析48 h，于4℃保存。純化效果采用15％SDS-PAGE進行分析。

1.2.4 Western blot參照李少兵等［8］的方法，標準品為GST-Aβ42融合蛋白，Mr約為30 000。加樣時，每孔10 μl(含Aβ42 20 μg)，恒壓120 V電泳。卸膠、清洗及裝架后，恒流50 mA電轉90 min。取出PVDF膜經雙蒸水洗滌、3％BSA封閉和TBST洗滌后，依次加入1∶100純化的樣品和1∶2 000的HRP-羊抗人IgG，室溫孵育2 h，上述兩步后分別用TBST洗滌5次，時間分別為1、2、 3、4、5 min。DAB顯色。以小鼠抗人Aβ42mAb（8G7）作為陽性對照。

1.2.5 免疫組織化學Tg2576鼠腦石蠟切片常規脫蠟入水，抗原修復。染色按SABC法并嚴格按照試劑盒說明進行。純化抗體的稀釋度為1∶100。以小鼠抗人單克隆Aβ1-42抗體作陽性對照。

1.2.6 統計分析全部數據采用SPSS 11.0分析。

2 結果

用ELISA方法，結果發現正常人、VD和AD病人血清中都出現抗Aβ自身抗體，但相比正常人和VD，AD患者的抗體含量明顯減少，而VD和HC組則沒有顯著性差異（表1）。AD的抗體含量與性別、年齡及MMSE評分都沒有相關關系。在VD和HC組，也沒有發現這種相關性。Western blot分析顯示，AD、VD及HC的純化Aβ自身抗體及小鼠抗人Aβ42mAb在Mr為30 000處有蛋白結合帶，與GST-Aβ42融合蛋白質的結合位置相符合（圖1）。免疫組化染色結果顯示，三組研究對象的純化抗體均不能與Tg2576鼠腦內的Aβ斑塊結合。

表1 研究對象臨床特征簡表(Mean±SD)

圖1 Western blot檢測血清Aβ自身抗體

3 討論

與以往結果［8-9］相似，本實驗發現AD患者及正常人血清中含有抗Aβ自身抗體，而與正常人相比，AD患者的抗體含量顯著降低。雖然VD與AD有不同的病理機制，但是在其血清中也發現了抗Aβ自身抗體，且與正常人相比無差異，而比AD患者則顯著升高。用Westernblot方法發現，純化的抗體均可檢測到GST-Aβ42融合蛋白。但是AD患者的抗體含量與性別、年齡及MMSE評分沒有相關性。雖然隨著年齡的增加，老年人的免疫反應呈下降的趨勢，但是AD患者Aβ自身抗體含量的降低與老年人總體免疫反應水平下降無相關性［10］。因此這些結果提示，Aβ自身抗體的降低是AD病人特有的免疫低反應性所致。Monsonego等［11］也觀察到了相似的結果，用Aβ肽接種APP轉基因鼠和野生鼠，發現在轉基因鼠誘導出的Aβ抗體水平明顯低于野生鼠。轉基因鼠及AD病人的T淋巴細胞體外培養也發現，Aβ肽誘導的T淋巴細胞增殖反應較非轉基因鼠明顯降低［12-13］，認為這可能是由于T細胞對Aβ肽產生耐受，導致對B細胞的輔助作用下降，不足以產生足夠的和有效的抗體以清除體內的Aβ，從而導致老年斑的形成。

從血清中純化的Aβ自身抗體是多克隆性的，可能含有大量的與Aβ肽有不同親和力的抗體［14］。雖然Du等［14］用免疫沉淀法證明親和純化的Aβ自身抗體能與人工合成的可溶性的Aβ肽結合，但是這些抗體能否和含有大量不溶性Aβ且具有β折疊結構的老年斑結合，沒有進一步探索。本實驗分別用AD、VD及HC血清的純化抗體與T g2576鼠的腦片孵育，發現AD、VD和HC的抗體均不能識別腦片中的老年斑，顯示出與老年斑的低親和力。因此推測AD病人的體內很可能存在產生Aβ自身抗體的特異性的免疫機制異常。這些抗體雖然可以結合可溶性的Aβ肽，但是卻不能識別老年斑。目前有研究認為人體（包括各個年齡組的正常人群[15]）內出現的Aβ抗體并不是針對老年斑而是針對外周Aβ，如血小板產生的Aβ［6］，因此可以理解這些抗體并不能特異性的識別老年斑。

用Aβ肽或Aβ單克隆抗體接種AD轉基因鼠都可以導致鼠腦內Aβ的減少及老年斑的清除［17］。其機制可能有抗體抑制Aβ折疊結構的形成、增加Aβ纖維的解聚并激活小膠質細胞清除Aβ［18］，以及通過外周降解可溶性的Aβ肽從而使中樞和外周的Aβ平衡破壞，使中樞內的Aβ流向外周，達到清除腦內Aβ的目的［19］。但是在AD病人體內，自身抗體的病理生理作用仍然不清楚。這些低水平、低親和力的抗體是否通過外周降解途徑降解Aβ還是有別的作用機制或臨床意義仍然需要進一步研究。

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Reduced low-affinity anti-β-amyloid autoantibodies in serum from Alzheimer’s disease

DUAN Jinhai1,XU Shuwen1,MO Jiannwei1,XIAO Hao1,Mo Sijie2,HU Tao21Neurology Department,Guangdong General Hosptial(Guangdong Academy of Medical Sciences).Guangdong Institute of Geriatrics.Guangdong Institute of Neurosciences,Guanzhou 510080,China;2Nanhai welfare centre,Nanhai City,foshan 528226,China

ObjectiveTo investigate the characterization of anti-Aβ autoantibodies in AD patients and affinity ability of autoantibodies stainning the Aβplaques in vitro.MethodsELISA was performed to detect levels of naturally occuring anti-Aβautoantibodies in surum from AD patients,vascular dementia and age-macthed healthy controls.Immunohistochemistry assay was employed to confirm the affinity abillity of anti-Aβautoantibodies stainning the Aβ plaques in vitro.ResultsNaturally occuring anti-Aβautoantibodies in surum from AD patients was significantly lower than those from vascular dementia and healthy controls.The autiantibodies levels were independent of gender,age and MMSE scores in AD patients. Autoantibodies purified from healthy individuals and vascular dementia patients could readily stain the Aβplaques in transgenic mouse Tg2576,while those from AD patients could not.ConclusionCompared with vascular dementia and healthy controls,AD patients have obviously lower anti-Aβautoantibodies which could not stain Aβplaques in transgenic mouse and showed a low-affinity ability with Aβplaques in vitro.The petential pathophysiological function of autoantibodies in AD patients needs futher study.

Alzheimer's disease;Vascular dementia;anti-Aβ autoantibody

2014-05-23

廣東省自然科學基金（7300973，S2012010009108）；廣東省科技計劃項（2010B031600167）

段金海，副主任醫師，博士，電話：020-83827812-70711，E-mail: duanjh888@hotmail.com