針藥并用對子宮內膜異位癥大鼠血管內皮生長因子的影響

張春雁,張曉云,李連波,朱俊,周殷,陳云飛

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針藥并用對子宮內膜異位癥大鼠血管內皮生長因子的影響

張春雁1,張曉云2,李連波1,朱俊1,周殷1,陳云飛1

(1.上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院,上海 200437;2.上海中醫藥大學附屬龍華醫院,上海 200030)

觀察針藥配合對子宮內膜異位癥(endometriosis,EMs)大鼠血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表達的影響,探討針藥配合治療子宮內膜異位癥的作用機制。建立大鼠EMs模型,隨機分為模型組、針灸組、中藥組、針藥組,并設立假手術組。針灸組電針血海、三陰交,艾灸關元;中藥組采用加味沒竭片生理鹽水混懸液灌胃;針藥組采用上述兩種方法綜合治療;假手術組和模型組捆綁固定并行生理鹽水灌胃。治療30 d后,取腹腔灌洗液及血清ELISA法檢測VEGF水平,測量異位囊腫最大直徑,取異位組織進行組織病理學觀察,免疫組化法測定組織中VEGF的蛋白水平。針藥組異位囊腫最大直徑明顯小于模型組、針灸組及中藥組(＜0.01);模型組異位內膜生長旺盛,針藥組內膜趨于萎縮,部分上皮細胞壞死;模型組腹腔灌洗液和異位組織中VEGF的表達顯著高于其他各組,針藥組腹腔灌洗液VEGF表達顯著低于模型組、中藥組、針灸組(＜0.01),針藥組異位組織中VEGF表達強度低于模型組(＜0.01)和中藥組(＜0.05)。大鼠EMs發病與其病變局部及腹腔微環境中VEGF水平相關,針藥配合能縮小EMs大鼠子宮內膜囊腫大小,下調異位組織及腹腔液中異常升高的VEGF蛋白表達。

針藥并用;大鼠;子宮內膜異位癥;血管內皮生長因子

子宮內膜異位癥(endometriosis,EMs)是指具有生長功能的子宮內膜組織出現在子宮腔被覆黏膜以外的身體其他部位。臨床上以痛經、不孕和月經失調作為其主要癥狀,嚴重影響患者的生活質量。該病多發生在30～45歲女性,發病率呈逐年上升趨勢。目前,EMs的臨床診治指南,主要是針對疼痛、包塊和不孕的手術、藥物及助孕技術等治療對策[1]。但該病難以根治,術后3年復發率高達38%～51%[2],且上述療法均存在缺陷[3]。因此,弄清EMs可能的發病機制,探索有效的、副反應少、復發率低的治療手段,是當前婦科學亟待解決的問題之一。中醫學在EMs的治療上具有獨特的優勢,針灸和中藥作為兩大治療手段,在該病的治療上已取得了滿意的療效[4-6]。

對于EMs發病機制的認識,目前較為公認的是Sampson等[7]于1922年提出的子宮內膜種植學說,認為EMs的發病存在異位內膜種植侵襲、新生血管形成等重要過程。我們前期研究證實[8],大鼠EMs的發病與異位組織中異常升高的基質金屬蛋白酶-2 (matrix metalloproteinase-2,MMP-2)有關,針藥結合可能通過下調內異癥大鼠異位組織中異常升高的MMP-2表達水平,達到縮小異位囊腫、治療大鼠內異癥的效應。但是隨著逆流經血侵襲局部基質并種植在腹腔或其他部位的異位內膜,其生長還需要形成自身的血管網以獲取營養物質,異位病灶周圍的血管化程度是影響異位內膜生長力和侵襲力的重要因素之一。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是一種結合肝素的二聚體糖蛋白,它直接作用于血管內皮細胞,是迄今為止發現的最為重要的血管生長因子。VEGF在EMs發病中究竟扮演怎樣的角色?

本研究在前期工作基礎上,采用針灸配合中藥加味沒竭片作用于EMs大鼠模型,對大鼠EMs可能的發病機制以及針藥配合治療大鼠EMs的效應及其可能的機理,從血管生成角度進行了深入的研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

由上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院實驗動物中心[SYXK(滬)2011-0109]提供,上海市斯萊克實驗動物有限責任公司[SCXK(滬)2012-0002]生產,清潔級雌性成熟未交配SD大鼠50只,體重(200±20)g,給予標準光照周期(14 h光照、10 h黑夜),室內溫度(20±2)℃,濕度(50±10)%,標準飼料。

1.2 器械、藥品

毫針(中研太和牌,0.22 mm×25 mm)、艾炷(綠瑩牌,6.5 mm×15 mm)、加味沒竭片(滬藥制字Z05050329, 0.3 g/片,120片/瓶)。

1.3 儀器設備

G6805-1A型治療儀(上海華誼醫用儀器廠)、Model 680酶標儀(美國BIO-RAD公司)、OLYMPUS-BX43型顯微照相系統(奧林巴斯光學工業株式會社)等。

1.4 試劑

抗大鼠VEGF單克隆抗體(珠海市泉暉企業有限公司,RTU-VEGF-qh,Batch:130410201)、GTVisionTMⅢ抗鼠/兔通用型免疫組化檢測試劑盒[Gene Tech (shanghai)Company Limited Code No GK500705]、Rat VEGF Immunoassay(R&D Systems Cat No RRV00,檢測血清中VEGF含量)、大鼠VEGF酶聯免疫試劑盒(武漢新啟迪生物科技有限公司Cat No EIA05906,檢測腹腔灌洗液中VEGF含量)。

1.5 實驗方法

1.5.1 分組與模型制作

將50只大鼠隨機分為假手術組10只和造模組40只,陰道脫落細胞涂片動態監測大鼠動情周期,在動情期,造模組參照Jones法[9]進行手術造模,假手術組進行假手術,開腹方法同造模組,找到左側子宮,用血管鉗夾持牽拉子宮角,分層關閉腹腔。常規飼養21 d后,開腹探查,見異位囊腫形成,取部分異位囊腫行組織病理學檢查,驗證EMs大鼠模型建立成功。將造模組隨機分為模型組10只、針灸組10只、中藥組10只、針藥組10只。

1.5.2 治療及對照處理

假手術組和模型組進行捆綁固定和生理鹽水灌胃,針灸組進行捆綁針灸和生理鹽水灌胃,中藥組進行捆綁固定和加味沒竭片生理鹽水混懸液灌胃,針藥組采用捆綁針灸和加味沒竭片生理鹽水混懸液灌胃。

1.5.2.1 針灸

捆綁固定后,選取單側血海、三陰交和關元3穴(大鼠穴位定位參照文獻[10])。以毫針刺入血海與三陰交,接G6805治療儀,采用連續波,電流強度0.3～0.6 mA,每日單側1次,次日換另一側穴位,雙側交替治療;關元穴處貼置6.5 mm×15 mm的艾炷,點燃施灸,每次2壯,每日1次。

1.5.2.2 灌胃

生理鹽水灌胃參照《動物實驗方法學》[11],根據大鼠體重,按照10 mL/kg計算灌胃量。加味沒竭片生理鹽水混懸液灌胃參照《動物實驗方法學》[11],根據成人藥物劑量換算大鼠等效劑量為3.74 mg/kg,并根據大鼠體重,按照10 mL/kg計算灌胃量,每次灌胃前將配制好的混懸液顛倒混勻。

1.5.2.3 療程

每日1次,30 d為1個療程,共治療1個療程。

1.5.3 取材與指標檢測

療程結束后,陰道脫落細胞涂片動態監測動情周期,在動情期對大鼠進行取材及相應指標檢測。

1.5.3.1 腹腔灌洗液VEGF表達水平檢測

按Nagelschmidt等[12]報道的方法,先將3 mL 0.15 mol/L PBS Buffer自左側腹部注入腹腔,將腹部輕微振蕩2 min后,用注射器自腹腔將灌洗液抽出,離心并收集上清液。采用ELISA法檢測,按照相應的試劑盒說明書進行操作。

1.5.3.2 血清VEGF表達水平檢測

開腹取各組大鼠外周血,離心取血清。采用ELISA法檢測,按照相應的試劑盒說明書進行操作。

1.5.3.3 異位囊腫大小測量

大鼠開腹后,找到異位囊腫,用游標卡尺測量并記錄最大直徑。

1.5.3.4 組織VEGF表達水平檢測

取子宮組織、異位內膜組織置于10%中性緩沖福爾馬林溶液中固定,脫水,石蠟包埋,3mm連續切片,采用免疫組織化學法檢測組織片中VEGF含量。VEGF主要表達于子宮內膜間質細胞及血管內皮細胞的細胞漿中,以間質細胞或血管內皮細胞胞漿呈棕黃色為陽性。免疫組化陽性判定方法參照Donnez等[13]的報道并予以改進,采用盲法,3名研究者(病理醫生)分別完成,任取連續5個高倍(×400)視野計數陽性細胞百分比,取平均值,判定該組織片VEGF表達陽性強度。設定3個評分等級,陽性細胞數≤25%為弱陽性,陽性細胞數26%～50%為陽性,陽性細胞數＞50%為強陽性。

1.5.4 統計學方法

各組異位囊腫最大直徑,血清及腹腔灌洗液中VEGF水平比較,采用方差分析;各組組織中VEGF陽性強度比較,采用卡方檢驗或’確切概率法。采用SPSS16.0,以≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 各組異位囊腫大小比較

假手術組未見異位囊腫,模型組異位囊腫最大直徑[(4.950±0.268)mm]顯著大于其他各組(＜0.01),針藥組[(1.760±0.317)mm]顯著小于模型組、針灸組[(3.290±0.166)mm]和中藥組[(3.480±0.148)mm] (＜0.01)。異位囊腫大小可直接指示內異癥的治療情況,本研究采用異位囊腫最大直徑衡量其大小,結果提示針灸、中藥和針藥配合對大鼠EMs有一定的治療效應,其中針藥配合效果優于單純針灸或中藥。詳見圖1。

2.2 在位內膜和異位內膜組織病理學觀察

假手術組子宮內膜上皮細胞排列整齊,呈柱狀或立方狀,胞漿豐富,間質豐厚,間質細胞多,可見腺腔,腺上皮細胞呈柱狀或立方狀,內膜腺體彎曲擴張;模型組異位內膜上皮細胞呈高柱狀,腺體彎曲擴張或無腺體,間質致密,血管豐富;針灸組和中藥組異位內膜上皮細胞排列雜亂或略整齊,呈柱狀或立方狀,間質疏松,間質細胞較少,無腺體,血管較少;針藥組異位內膜趨于萎縮,上皮細胞排列稀疏,部分細胞壞死,間質疏松,間質細胞較少,無腺體,血管較少。

圖1 各組大鼠異位囊腫最大直徑比較(Mean±2SD)

2.3 組織中VEGF蛋白表達

VEGF在子宮內膜組織中主要表達于子宮內膜間質血管內皮細胞胞漿。免疫組化結果顯示,假手術組子宮內膜組織中VEGF表達呈弱陽性;模型組異位內膜組織鏡下可見大量毛細血管,血管內皮細胞VEGF表達呈強陽性。異位內膜組織中VEGF蛋白表達,模型組20%(2/10)呈陽性、80%(8/10)呈強陽性,針灸組60%(6/10)呈弱陽性、40%(4/10)呈陽性,中藥組50%(5/10)呈弱陽性、50%(5/10)呈陽性,針藥組100%(10/10)呈弱陽性。模型組異位內膜組織VEGF陽性強度高于其余各組(＜0.01);針藥組與針灸組比較異位內膜組織VEGF陽性強度無統計學差異(=0.087),針藥組異位內膜組織VEGF陽性強度低于中藥組(=0.033)。詳見表1、圖2,箭頭處為陽性表達細胞。

表1 大鼠子宮內膜與異位內膜組織中VEGF蛋白表達的比較 [n(%)]

注:與模型組比較1)＜0.01,與中藥組比較2)＜0.05

2.4 腹腔灌洗液中VEGF蛋白水平

模型組大鼠腹腔灌洗液中VEGF含量[(6.314±0.212)ng/mL]明顯高于其他各組(＜0.01),針藥組[(6.444±0.279)ng/mL]明顯低于模型組、針灸組[(8.425±0.146)ng/mL]和中藥組[(8.259± 0.243)ng/mL](＜0.01)。結果提示EMs大鼠腹腔灌洗液中VEGF濃度異常升高,針灸、中藥和針藥配合均可下調EMs大鼠腹腔灌洗液中異常升高的VEGF濃度,其中針藥結合效果優于單純應用針灸或中藥。詳見表2。

2.5 血清中VEGF蛋白水平

采用ELISA法測定各組大鼠血清中VEGF含量,結果測定的濃度值為負值,無法統計比較。分析可能由于大鼠血清中的VEGF濃度較低,EMs大鼠血清中VEGF的含量并未升高。

表2 各組大鼠腹腔灌洗液VEGF含量比較 (±s,ng/mL)

注:與假手術組比較1)＜0.01;與模型組比較2)＜0.01;與針灸組比較3)＜0.01;與中藥組比較4)＜0.01

圖2 大鼠子宮內膜與異位內膜組織VEGF表達(IHC×400)

3 討論

中醫學將子宮內膜異位癥歸為“痛經”、“癥瘕”、“月經不調”、“不孕”的范疇,病因病機多責之于血瘀,在治療上取得了一定的成效。針灸和中藥是中醫學的傳統治療手段,多年來廣泛應用于對本病的治療中。臨床資料顯示,針灸對EMs的療效明顯,目前多采用針刺[14]、溫通藥灸[15]、穴位敷貼[16]、針灸并用[17]、穴位注射加隔藥餅灸[18]、針藥并用[5]等治療方法,臨床多選用血海、三陰交等為主穴,血海為足太陰脾經腧穴,具有調經統血的作用,是治療婦科疾病的要穴;三陰交為足三陰經交會穴,可以調氣活血,疏經止痛,而本病的發病與肝、脾、腎三臟密切相關,故乃治療主穴;關元系足三陰、陽明、任脈、沖脈之會,任沖二脈皆起于胞宮,任脈為“陰脈之海”,沖脈為“血海”,該穴又位于臍下三寸,鄰近胞宮,故亦為治療EMs之要穴。上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院朱氏婦科長期運用“加味沒竭片”治療EMs,具有活血化瘀,破氣行滯,消積定痛的功效,積累了大量的臨床經驗[19]。但是針灸與中藥治療EMs其效應機制尚未闡明,且臨床研究多局限于針灸或中藥單一的治療方法,較少將兩者結合進行研究。

異位囊腫形成是大鼠EMs的主要表現,異位囊腫的大小直接指示EMs的病理狀態,對于療效的判定,亦是比較客觀的證據[20]。本研究選取異位囊腫最大直徑的測量結果對治療效應進行評判,結果證實,經針藥配合治療的EMs大鼠,其異位囊腫最大直徑較模型組、針灸組、中藥組明顯減小,提示針藥配合可有效減小異位囊腫大小,且該作用優于單純應用針灸或中藥。通過組織病理學觀察亦證實針藥結合具有延緩EMs異位組織細胞生長,促進異位組織萎縮的效應。

在EMs的形成與發展中,VEGF的含量增高,在自分泌和旁分泌的共同作用下,刺激毛細血管增生,為異位生長的腺上皮細胞提供賴以生存的物質基礎,促進異位內膜增殖和浸潤入盆腔和腹腔內組織,形成盆腔和腹腔的異位灶[21-22]。有研究顯示[23],VEGFs和NRPs等生長因子及其受體表達的失調可能導致EMs血管生成、淋巴管生成、神經與免疫功能的改變。EMs組織中血管內皮生長因子C表達增加,可增強內皮功能,增加血管通透性,促進血管生成和異位組織生長[24]。朱虹等[25]研究顯示,盆腔外EMs、卵巢EMs的異位內膜中存在VEGF的高表達,可能導致了血管生成,利于種植及生長,可能成為EMs早期診斷的指標。動物實驗發現[26],在人子宮內膜間質細胞與裸小鼠的腹膜間皮細胞黏附的第1天,小鼠子宮內膜間質細胞已有VEGF mRNA的表達。這說明子宮內膜間質細胞分泌的VEGF很可能是異位病灶中最早的促血管生成因子。

本研究選取VEGF從新生血管形成的組織發生機理角度,分別從組織本身和腹腔微環境,評估異位內膜組織血管形成作用。結果證實,假手術大鼠在位內膜中血管較少,間質細胞或血管內皮細胞VEGF呈弱陽性表達,腹腔灌洗液中VEGF含量較低;EMs模型大鼠異位內膜組織中血管較為豐富,間質細胞或血管內皮細胞中VEGF呈強陽性表達,有大量新生血管,腹腔灌洗液中VEGF含量異常升高,這就促進了異位組織的血供,有利于異位組織的進一步生長,這與張旭賓等[27]研究報道一致。而針灸組、中藥組和針藥組異位內膜組織VEGF呈弱陽性或陽性表達,腹腔灌洗液中VEGF含量較低,尤其是針藥組含量趨近于假手術組,且異位內膜組織中VEGF表達強度低于中藥組,提示針藥結合對EMs大鼠異位內膜組織血管形成具有較好的抑制作用,使得提供異位組織生長的營養物質相對減少,考慮這也是導致針藥組異位囊腫縮小、異位內膜組織萎縮的可能原因。

本研究結合VEGF在EMs發病中的作用,及針藥結合治療大鼠EMs的療效觀察,分析針藥配合發揮療效可能是通過下調異位內膜組織及腹腔微環境中VEGF蛋白的表達,從而削弱異位內膜血管形成作用,減少局部的營養供應,進而達到治療大鼠EMs的效應。推測下調異位內膜組織和腹腔微環境中VEGF蛋白的表達是針藥配合治療大鼠EMs的可能機制之一。對于針藥結合對異位組織中VEGF蛋白表達的調節作用,目前尚未見相關報道。但VEGF促進血管形成的始動因素是什么,如何更有效地控制血管形成,減少異位組織血供,將異位組織扼殺?這些均有待于進一步研究探索。

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Effect of Combined Acupuncture and Medicine on the Expression of Vascular Endothelial Growth Factor in Endometriosis Rats

-1,-2,-1,1,1,-1.

1.,,200437,; 2.,200030,

To investigate the effect of acupuncture combined with Jiawei Mojie Pian on the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) in endometriosis (EMs) rats and explore the mechanism of action of combined acupuncture and Chinese herbal medicine in treating endometriosis.A rat model of EMs was made. The rats were were randomly allocated to model, acupuncture, Chinese herbal medicine and acupuncture plus medicine groups. A sham operation group was set up. The acupuncture group received electroacupuncture at Xuehai (SP10) and Sanyinjiao (SP6) and moxibustion on Guanyuan (CV4); the Chinese herbal medicine group, an oral gavage of a suspension of Jiawei Mojie Pian in normal saline; the acupuncture plus medicine group, a combined treatment with the above two methods. The sham operation and model groups were bound and fixed, and given an oral gavage of normal saline.The peritoneal lavage fluid and serum were taken after 30 days of treatment. VEGF levels were measured by ELISA. The maximum diameter of ectopic cyst was determined. The ectopic tissue was taken for histopathological observation. The protein level of tissue VEGF was measured by immunohistochemical method.The maximum diameter of ectopic cyst was significantly shorter in the acupuncture plus medicine group than in the model, acupuncture and Chinese herbal medicine groups (＜0.01). Ectopic endometrium grew vigorously in the model group. The endometrium tended to atrophy and part of the epithelial cells became necrosis in the acupuncture plus medicine group. The expression of VEGF in the peritoneal lavage fluid and ectopic tissue was significantly higher in the model group than in the other groups. The expression of VEGF in the peritoneal lavage fluid was significantly lower in the acupuncture plus medicine group than in the model, Chinese herbal medicine and acupuncture groups (＜0.01). The expression of VEGF in the ectopic tissue was significantly lower in the acupuncture plus medicine group than in the model and Chinese herbal medicine groups (＜0.01 and＜0.05, respectively).The occurrence of EMs in rats is related to VEGF levels in the lesion and abdominal cavity microenvironment. Combined acupuncture and medicine can reduce the size of ectopic endometrium tissue and down-regulate the abnormally increased expression of VEGF protein in the ectopic tissue and peritoneal fluid in EMs rats.

Combined use of acupuncture and medicine; Rats; Endometriosis; Vascular endothelial growth factor

1005-0957(2014)08-0764-05

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2014.08.0764

2014-03-20

上海市自然科學基金項目(13ZR1442800);上海市衛生局中醫藥科研基金項目(2012QL006A)

張春雁(1981 - ),女,主治醫師,上海中醫藥大學2011級博士生

陳云飛(1968 - ),男,研究員,Email:icyf1968@163.com