腦膠質瘤中miR-7與EGFR/PI3K信號通路相關基因蛋白表達的關系

劉亮洪，張洪云，劉曉智，張立東，姜忠敏

(1天津港口醫院，天津塘沽300456;2天津市第五中心醫院)

膠質瘤的發生、發展本質上是多種基因共同作用致使基因表達失衡的結果，而基因表達受基因水平、轉錄水平、轉錄后水平及蛋白水平等多層面的調控，其中微小RNA(miRNA)在轉錄后水平對基因表達的精細調控近年來倍受關注。miRNA是一類大小約22個核苷酸的內源性非編碼小RNA，通過與信使RNA(mRNA)的3'端非翻譯區(3'UTR)完全或不完全互補結合降解靶mRNA或抑制其翻譯，對其表達水平進行轉錄后調控，在腫瘤的形成過程中發揮著類似癌基因或抑癌基因的作用［1，2］。我們在前期工作中發現，在膠質瘤細胞系中轉染miR-7后抑制了腫瘤的生長，但具體機制尚不清楚。2009年1月～2013年12月，我們觀察了腦膠質瘤組織、U251細胞中miR-7、EGFR/PI3K信號通路相關(EGFR、PI3K和AKT2)基因蛋白的表達，并探討其關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇天津市第五中心醫院和港口醫院神經外科收治的腦膠質瘤患者42例，手術切除腫瘤組織，其中8例選取瘤旁正常腦組織。42例膠質瘤患者按照WHO 2007年腦腫瘤分類標準分類:Ⅰ級6例，Ⅱ級16例，Ⅲ級9例，Ⅳ級11例。腦膠質瘤組織及正常腦組織均分為兩部分，一部分經甲醛固定后制作成蠟塊進行免疫組化染色;另一部分貯存于液氮，用于提取總RNA。U251膠質瘤細胞由天津醫科大學總醫院神經疾病研究所饋贈。

1.2 細胞培養與質粒轉染 細胞培養:U251膠質瘤細胞在37℃、5%CO2飽和濕度于含10%胎牛血清的DMEM中培養。隔天換液，每3 d傳代1次。實驗分組:①空白對照組，僅加入脂質體;②無義序列組，加入無義序列和脂質體;③miR-7轉染組:miR-7序列為5'-UUGUUUUAGUGAUCAAGAAGGU-3'。質粒轉染:細胞生長至60% ～70%匯合時，降低血清濃度至5%，然后將1 μg的質粒與100 μL的LipoVecTM混合20 min后加入培養基中，4 h后換成含20%血清的培養基繼續培養。轉染48 h后，用含200 ng/L G418的培養基進行篩選，每3 d更換選擇培養液1次。14 d后細胞集落形成，未轉染組細胞死亡。待陽性細胞生長至一定數量時，用24孔板進行細胞克隆與傳代擴增。

1.3 腦膠質瘤組織、U251細胞中miR-7檢測 采用RT-PCR法。在冰凍膠質瘤組織和空白對照組、無義序列組、miR-7轉染組細胞中利用TRIzol一步法提取總RNA;反轉錄后進行PCR循環反應。miR-7上游引物:5'-AAAAAGAACACGTGGAAGGATAG-3'，下游引物:5'-CCGCCTAACGTACCGCGAATTT-3'。反應條件:94℃、3 min后連續45個循環，每個循環內 94 ℃、30 s，60 ℃、45 s，72 ℃、30 s。以人18 rRNATaqman探針作為內參。目的基因mRNA相對表達量=目的條帶的灰度值/同一標本內參的灰度值。

1.4 腦膠質瘤組織中EGFR、PI3K和AKT2蛋白檢測 采用Envison兩步法。選取石蠟組織塊，連續切片，厚4 μm，常規HE染色及免疫組化染色。免疫組化染色步驟按試劑盒說明書操作進行。每次實驗均設立相應的陽性對照，PBS液代替一抗作為空白對照。

1.5 U251 細胞中 EGFR、PI3K、AKT2 mRNA 和蛋白檢測 將轉染miR-7后的U251細胞、無義序列組及空白對照組分別提取RNA和蛋白，用RT-PCR檢測EGFR、PI3K、AKT2 mRNA 表達，方法如下:采用TRIzol一步法提取總RNA，然后利用RT-PCR試劑盒，按說明書詳細步驟進行。采用Western blotting法檢測 EGFR、PI3K、AKT2蛋白表達，方法如下:U251細胞轉染miR-7后提取總蛋白，Bradford法蛋白定量。電泳后考馬斯亮藍染色，蛋白分離滿意后轉膜，Western封閉液37℃封閉2 h，PBS充分漂洗后滴加相應一抗，抗體稀釋度分別為EGFR(1∶500)、PI3K(1∶500)和AKT2(1∶1 000)，4 ℃水平搖床過夜，次日使用辣根酶標記的1∶500稀釋二抗37℃、2 h。化學發光試劑盒顯影，Bio-Rad凝膠成像系統掃描光密度值，Quantity One軟件分析。

1.6 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件。計量資料以±s表示，組間比較采用ANOVA單因素方差分析，組間多重比較采用q檢驗;計數資料采用例(%)表示，組間比較采用χ2檢驗;miR-7與EGFR/PI3K信號轉導通路成員之間的相關性用Spearman等級相關分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腦膠質瘤組織中miR-7、EGFR/PI3K信號通路相關蛋白表達的關系 miR-7在腦膠質瘤和正常腦組織中的分別為 1.47±0.27、3.47±0.15，二者比較，P＜0.05。miR-7在WHOⅠ～Ⅳ級膠質瘤組織中分別為 2.12± 0.24、1.97± 0.20、0.96± 0.15、0.55±0.13，Ⅰ、Ⅱ級比較無統計學差異，其余兩兩比較均有統計學差異(P均＜0.05)。

EGFR、PI3K和AKT2在腦膠質瘤中的著色部位均定位在細胞膜或細胞質。隨著膠質瘤WHO級別的增加，EGFR、PI3K和AKT2表達均有不同程度的增加，且差異有統計學意義(P＜0.05)。miR-7與EGFR、PI3K、pAKT在腦膠質瘤組織中的表達呈負相關(r分別為 －0.754、－0.528、－0.467，P 均 ＜0.05)。

2.2 U251細胞中miR-7、EGFR/PI3K信號通路相關基因蛋白表達的關系 miR-7轉染組與空白對照組、無義序列組比較，EGFR、PI3K和AKT2的表達均明顯增加(P均＜0.05)。結果見表1。

表1 U251細胞中miR-7、EGFR、PI3K、AKT2 mRNA 表達水平(±s)

表1 U251細胞中miR-7、EGFR、PI3K、AKT2 mRNA 表達水平(±s)

注:與空白對照組、無義序列組比較，*P＜0.05

組別miR-7 mRNA EGFR mRNA PI3K mRNAAKT2 mRNA miR-7 轉染組 2.36±0.18*0.81±0.09*1.01±0.12Δ*0.99±0.10*空白對照組 0.54±0.09 2.11±0.11 1.98±0.10 1.74±0.14無義序列組0.68±0.12 2.27±0.13 1.93±0.13 1.71±0.15

3 討論

研究［3，4］表明，膠質瘤的發生、發展與多條基因通路表達失控密切相關，調控基因通路表達的因子眾多，其中miRNA在轉錄后水平對某些基因通路表達的精細調控近年來倍受關注。研究［5］表明，在膠質瘤細胞中有多種miRNA的表達存在差異，其中miR-7是差異最顯著者之一。Kefas等［6］首先報道在膠質瘤細胞中出現miR-7低表達及其可能充當抑癌基因角色。本課題組的前期研究［7］發現，轉染miR-7的膠質瘤細胞其增殖細胞周期及細胞遷移能力受到明顯抑制。本研究發現，隨著膠質瘤級別的增高，miR-7的表達呈顯著降低趨勢，該結果提示miR-7表達減少或缺失可能是膠質瘤發生、發展過程中的重要分子事件。

EGFR是一種跨細胞膜糖蛋白，是酪氨酸激酶受體erbB家族成員。EGFR與配體結合后，受體酪氨酸激酶自磷酸化，激活下游信號通路，調控細胞增殖、分化。該因子突變、擴增與過表達是惡性膠質瘤尤其是原發性膠質母細胞瘤早期和主要的分子事件，它通過下游通路成員推進腫瘤細胞的細胞周期、抑制細胞凋亡、加強端粒酶活性、促進腫瘤血管生成和腫瘤侵襲［8］。活化的EGFR主要通過兩條信號轉導途徑將信息轉至細胞核，一條是ras-raf-MEK-Erk/MAPK途徑，信號經Shc、Grb2傳遞，最后經c-jun、cfos傳到核內;另一條是PI3K-AKT途徑，導致NF-κB移位至核內，這種信號轉導的級聯反應引起核內效應基因，特別是細胞周期調控元件的激活和轉錄，調控細胞生長［9］。

Wang等［10］研究報道miR-7的基因序列與EGFR基因3'-UTR區存在至少3個區域的不完全互補，同時與EGFR通路成員AKT-2的上游調節因子IRS-1和IRS-2的3'-UTR區存在數個片段的不完全互補，通過抑制EGFR和AKT-2的蛋白質表達，實現了對膠質母細胞瘤的增殖抑制作用。我們前期工作發現轉染miR-7可有效逆轉其惡性表型，本實驗對其調節機制做了進一步研究，發現轉染miR-7的膠質瘤細胞EGFR/PI3K通路主要成員的表達受到了明顯的抑制。另外我們又在腦膠質瘤標本中檢測miR-7和EGFR/PI3K通路主要成員(EGFR、PI3K、AKT)的表達情況發現，隨著WHO級別的增加miR-7表達呈顯著下降趨勢，而EGFR、PI3K、AKT表達則顯著增加，三者與miR-7表達呈顯著負相關，該結果與在膠質瘤細胞系中的研究結論基本一致，說明EGFR/PI3K通路可能是miR-7調控膠質瘤發生發展的重要機制之一。

應用抗人EGFR單克隆抗體靶向EGFR信號通路治療惡性腫瘤已經成為腫瘤綜合治療新的途徑和熱點。隨著對miR-7功能研究的不斷深入，越來越多的證據表明miR-7可能通過不同的途徑激活EGFR信號通路而調控膠質瘤的發生、發展;miR-7可能成為人腦膠質瘤靶向治療的一個新的研究靶點。

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