全骨髓貼壁法體外分離培養兔骨髓間充質干細胞

宋明艷，李 娜，姜 彥，于龍剛

(1青島大學醫學院，山東青島266071;2青島大學醫學院附屬醫院)

近年來，隨著組織工程學、細胞及基因治療技術的衍生和發展，骨髓間充質干細胞(BMSCs)因具有來源廣泛、取材方便、可多向分化、易于分離培養及純化等優點，被視為理想的種子細胞，受到越來越多的關注［1］。BMSCs的工程需求量較大，但它在骨髓中數量卻極少，僅占單核細胞的0.001% ～0.01%，需要體外分離純化和大量增殖，這也是推廣組織工程學應用的重要前提［2］。因此如何高效獲取并鑒定BMSCs成為研究的重要任務。2013年8～12月，我們采用全骨髓貼壁法從兔骨髓中分離出BMSCs進行培養，過程中檢測細胞活性，鑒定細胞多向分化能力，對所獲取的細胞進行綜合評價，探討此方法分離培養BMSCs的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料 純種新西蘭大耳白兔，4周齡，雌雄不限，體質量約1.0 kg，由青島市實驗動物中心提供。實驗所有過程中對兔的處置符合《關于善待實驗動物的指導性意見》要求。DMEM/F12培養基、胎牛血清，0.25%胰蛋白酶，地塞米松、β-磷酸甘油、抗壞血酸、1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤、吲哚美辛，堿性磷酸酶檢測及脂肪細胞油紅O染色試劑盒。

1.2 兔BMSCs的分離和原代培養 用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉兔子，刮除其雙下肢毛發，用1%的碘伏消毒術區，鋪無菌洞巾，解剖出雙側股骨，剔凈肌肉及骨膜，75%乙醇浸泡5 min后轉移到超凈工作臺。PBS緩沖液沖洗3遍股骨，剪去兩側部分干骺端，用加有肝素的DMEM/F12培養基反復沖洗骨髓腔，收集骨髓混合液于離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入DMEM/F12培養基(含體積分數為10%的胎牛血清)制成單細胞懸液。將細胞以2×105/cm2的密度接種于底面積25cm2培養瓶中，置于37℃、體積分數5%CO2、飽和濕度下的培養箱內孵育。24 h后首次半量換液，棄去未貼壁的細胞，此后平均每48 h換液1次，嚴格無菌操作，光鏡下觀察培養結果。

1.3 兔BMSCs的傳代培養 原代細胞達到90%融合度后，開始進行傳代。吸除原培養廢液，PBS緩沖液洗滌細胞3次，0.25%胰蛋白酶消化細胞，當光鏡下細胞由梭形變為圓形時，提示細胞已完全分離，立即加入含10%胎牛血清的培養基終止消化，并反復輕輕吹打瓶底貼壁細胞，制成單細胞懸液，并按照1∶3的比例進行傳代。原代細胞標記為P0，第一代標記為P1，以此類推，鏡下觀察細胞的形態及生長情況。

1.4 兔BMSCs的鑒定

1.4.1 貼壁率檢測 取P3代細胞，0.25%胰蛋白酶消化后，加入DMEM培養基制成單細胞懸液，以5×107/孔的密度接種到12孔培養板中，每2 h棄去2孔細胞培養液，再次消化貼壁細胞，進行細胞計數，并取平均值，計算各個時間點的貼壁率后繪制曲線。貼壁率(%)=已貼壁細胞數/接種細胞總數×100%。

1.4.2 細胞增殖檢測及生長曲線的繪制 取P3代細胞，0.25%胰蛋白酶消化后，加入DMEM培養基制成單細胞懸液，按1×107/L的密度接種到24孔培養板中，每天取3孔細胞消化后計數，取平均值，連續計數8 d，以培養時間為橫軸、細胞平均值為縱軸，繪制細胞生長曲線。

1.5 兔BMSCs分化能力檢測

1.5.1 兔BMSCs成脂誘導分化 取P3代細胞，當細胞達到90%融合后，加入脂肪細胞誘導劑(含LDMEM培養基、體積分數為10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 g/mL鏈霉素、1 μmol/L地塞米松、200 μmol/L 吲哚美辛及 0.5 mmol/L 1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤)，每3 d換液1次，10 d后行油紅O染色，鏡下觀察結果。

1.5.2 兔BMSCs成骨誘導分化 取P3代細胞，當細胞達到90%融合后，加入成骨細胞誘導劑進行誘導分化(含L-DMEM培養基、體積分數10%胎牛血清、100 U/L 青霉素、100 U/L 鏈霉素、10 mmol/L β-磷酸甘油、10－8mol/L地塞米松，50 mg/L抗壞血酸)，每3天換液1次，21 d后行堿性磷酸酶定性染色，鏡下觀察結果。

2 結果

2.1 兔BMSCs形態學變化 原代BMSCs接種24 h，可見較多懸浮雜質細胞，貼壁細胞較少且分散，細胞較小，近似圓形或短梭形。3 d后貼壁細胞增多，出現放射狀集落式生長，6 d后細胞集落生長明顯，呈旋渦狀或輻射狀，此時細胞以長梭形為主，還可見三角形、扁平形和其他不規則形。多次傳代后雜質被棄去，純度不斷提高，細胞生長活躍，形態較均一，維持長梭狀。

2.2 兔BMSCs的貼壁率曲線 此貼壁率曲線顯示，細胞培養2 h貼壁30%以上，4 h貼壁60%，8 h貼壁70%以上，12 h貼壁90%，充分反映了BMSCs旺盛的活力和快速增殖能力(見圖1)。

2.3 兔BMSCs的生長曲線 P3代細胞的生長曲線大體呈S形，細胞培養至第2天時，細胞數目無明顯增加，為細胞的適應期;3 d后細胞數迅速增加，大量細胞快速增殖，為對數生長期;6 d左右細胞數達到頂點，逐漸進入平臺期，此時細胞增殖明顯減慢(見圖2)。

圖1 P3代骨髓間充質干細胞的貼壁率

圖2 P3代骨髓間充質干細胞的生長曲線

2.4 兔BMSCs成脂誘導分化情況 第6天光鏡下初見細胞胞質內有黃色圓形脂滴沉著，細胞呈圓形，隨著誘導時間的延長，脂肪細胞的比例逐漸增高。培養到21 d時，脂滴明顯增大，胞核偏向細胞一側，經油紅O染色后，胞核呈現藍色，脂滴呈現橙紅色(見圖3)。

圖3 兔BMSCs來源的成脂細胞油紅O染色(×100)

2.5 兔BMSCs成骨誘導分化情況 BMSCs向成骨誘導6 d時，細胞開始由梭形變為長方形或多角形，21 d時行堿性磷酸酶定性染色，細胞核呈紫色，胞質出現紅棕色或褐色顆粒(見圖4)。

圖4 兔BMSCs來源的成骨細胞堿性磷酸酶染色(×100)

3 討論

20世紀70年代，Friedenstein等［3］利用全骨髓貼壁法最先從骨髓中分離培養出了間充質干細胞，這是一種來源于中胚層的成體干細胞，具有較強的自我更新能力，在不同的誘導條件下，可向中胚層和外胚層組織分化，如向成骨細胞、脂肪細胞、神經細胞、軟骨細胞、肌肉組織及支持造血的基質細胞等分化。間充質干細胞可以從骨髓、脂肪、臍帶、羊膜或牙髓等眾多組織中獲取，其中骨髓一直是其主要來源。BMSCs取材相對方便、培養周期短、增殖能力強、呈貼壁式生長，具有一定的免疫調節功能，避免了發生免疫排斥反應，且多次傳代后仍保持旺盛生命力，因此被組織工程學選為種子細胞和基因載體細胞，用于多種動物實驗、臨床及基因研究［4］。組織治療技術是利用干細胞的黏附性及分化更新特性，將干細胞與特定生物材料相結合，并將材料移植到受損組織處，用以修復或替代機體受損組織，目前此技術已經取得較大的成功，如對骨組織、心肌及外周神經損傷后的修復等［5］。所以BMSCs在組織工程學中起著關鍵作用，細胞的分離培養至關重要。

目前，BMSCs常用的分離培養方法有四種，即密度梯度離心法、全骨髓貼壁法、免疫磁珠及流式細胞儀分離法［6，7］。后兩種方法因為實驗要求多，費用高，對細胞活性有很大影響而較少使用。密度梯度離心法雖可在最初獲得較高純度的單核細胞，但因操作復雜，過程中的反復離心影響細胞的活性，又使得大量細胞及生物因子流失，故不作為首選方法。全骨髓貼壁法主要利用細胞的貼壁特性對全骨髓進行分離，雖然在原代細胞中混雜有一定數量的造血干細胞或成纖維細胞等雜質，但這些懸浮未貼壁的細胞可在換液及傳代的過程中被去除，而BMSCs則黏附于培養瓶底得以純化，最后仍可獲得較高純化率。部分研究［8］表明，細胞培養早期殘留的造血干細胞和其他雜細胞，有利于保持BMSCs的生長微環境，且骨髓中殘留的血小板和巨核細胞可通過分泌相關細胞生長因子，促進集落形成和細胞增殖。全骨髓貼壁法簡單易操作，分離時間短，細胞很少受到分離導致的損傷，獲得的BMSCs活性強、純度高，故是目前應用最多的分離方法。

BMSCs的鑒定目前沒有統一標準，尚未發現其特異性表面標記物［9，10］。研究者多從細胞形態、細胞表型或細胞功能三個方面著手鑒定干細胞［11］。干細胞表面抗原的檢測，僅僅用于判斷所得細胞的均一性或純度，或初步判斷其是否為一種非造血干細胞［12］。而檢測細胞的多向分化潛能才是鑒定BMSCs的金標準［13］。細胞形態方面如細胞呈類似成纖維細胞的梭形、貼壁式生長、克隆成集落快速增殖等均符合干細胞的形態學特征。在成骨及脂肪誘導劑作用下，向成骨及脂肪細胞轉化，充分顯示了干細胞的多向分化潛能以及自我更新的能力，符合干細胞的生物特性。S形生長曲線提示干細胞經歷了潛伏期、增殖期及平臺期，符合細胞的生長特性及增殖規律。細胞短時間內出現貼壁，培養12 h后貼壁率高達90%，反映出細胞超強的生存能力和活力［14］。

總之，全骨髓貼壁法可以比較簡便的分離培養出BMSCs，同時保證干細胞的純度及增殖活性，可適應組織工程對大量細胞的需求，對于提供充足高質量的種子細胞具有重大意義。

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