羅格列酮對大鼠急性腎損傷的保護作用及機制探討

谷名曉，江 璐，劉選成

(青島市婦女兒童醫院，山東青島266034)

急性腎損傷是多種原因造成的短期內腎功能的急劇下降，是影響機體多器官、多系統的臨床危重癥之一，發病率逐年增高。氧化應激反應是急性腎損傷發生、發展的重要機制。活性氧(ROS)與蛋白質、脂肪、核酸、碳水化合物以及其他分子發生強烈反應并使之變性引起炎癥反應、凋亡、纖維化和細胞增殖［1，2］。過氧化物酶體增殖物激活受體 γ(PPAR-γ)羅格列酮(RSG)是噻唑烷二酮類藥物，因其具有改善胰島素抵抗、降糖等作用作為胰島素增敏劑廣泛應用于臨床。近年研究［3］表明，除了上述作用外，RSG還具有抗炎抗氧化及直接的腎臟保護作用，但其具體機制尚未完全明了。本研究觀察了RSG對大鼠急性腎損傷的保護作用，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級SD大鼠30只，2月齡，體質量300～350 g，徐州醫學院實驗動物中心提供;慶大霉素(GEN)，RSG，超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)試劑盒，圖像采集及分析(LEICA QWIN)，752紫光光柵分光光度計，LEICA Qwin圖像處理與分析系統，NikonE600顯微攝像系統，PSD-156生化分析儀，TGL-16B臺式離心機，紫外分析儀。

1.2 動物分組及GEN用法 將30只大鼠隨機分為誘導組、干預組、對照組各10只，誘導組、干預組持續腹腔注射GEN 2周，劑量100 mg/(kg·d)，復制急性腎損害模型［4］，干預組同時以RSG 10 mg/(kg·d)灌胃，誘導組以生理鹽水灌胃，共2周;對照組不復制急性腎損害模型，單純以生理鹽水灌胃，共2周。

1.3 觀察方法 將大鼠置于代謝籠中，分別于注射藥物前1 d及實驗第15天稱取每只大鼠的體質量，計算體質量變化(注射藥物前1 d與實驗第15天的差值)。實驗第15天收集24 h尿液，并記錄。后采用5%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，摘眼球取靜脈血3 mL，采用全自動生化分析儀檢測尿素氮、肌酐。取大鼠左腎(右腎用于制備腎組織勻漿)，置于10%中性甲醛中，經脫水、包埋制成蠟塊，切片后行HE染色，顯微鏡下觀察腎組織病理學變化。采用Allen［5］的方法半定量評價腎組織的損害程度，對每張切片觀察50個近端小管，觀察有無腎小管壞死、上皮細胞空泡變性及間質炎性細胞浸潤三種病理學特征，對腎小管壞死、上皮細胞空泡變性及間質炎性細胞浸潤程度進行評價。腎小管壞死程度:0級表示正常腎小管，1級表示腎小管輕微傷害(＜25%腎小管受累)，2級表示腎小管中等傷害(25% ～50%腎小管受累)，3級表示腎小管嚴重傷害(50%及以上腎小管受累)。上皮細胞空泡變性程度:0級，光鏡下可見正常腎小管上皮細胞空泡;1級，可見上皮細胞腫脹，胞質淡染并且遍布微小空泡;2級，可見空泡變性主要發生在近端小管段，腎小管上皮細胞腫脹，胞質內出現邊界清晰的巨大空泡，空泡含液體;3級，可見腎小管上皮細胞融合，含鐵血黃素沉積、包涵體。間質炎性浸潤程度:0級表示無浸潤，1級表示少量分散的炎性細胞，2級表示成組的炎性細胞，3級表示廣泛的炎性細胞浸潤。取保存的右腎皮質，加冰冷生理鹽水，剪碎研磨制成組織勻漿，低溫離心取上清液后，嚴格按照南京建成公司試劑盒說明書操作，采用化學比色法測定MDA、SOD、GSH活性。

1.4 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件。計量資料以±s表示，各組間均數差異采用t檢驗。各組腎組織病理學評價的統計分析采用χ2檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠體質量變化、24 h尿量、尿素氮、肌酐比較 結果見表1。

表1 各組大鼠體質量變化、24 h尿量、尿素氮、肌酐比較(± s)

表1 各組大鼠體質量變化、24 h尿量、尿素氮、肌酐比較(± s)

注:與對照組比較，*P ＜0.05;與誘導組比較，ΔP ＜0.05

組別 體質量變化(g)24 h尿量(mL)尿素氮(mg/dL)肌酐(mg/dL)誘導組 －8.35±3.45*24.82±3.05* 126.3±8.9* 1.81±0.1*干預組 11.68±3.43*Δ14.08±0.79*Δ 53.9±7.0*Δ 0.64±0.15*Δ對照組36.00±2.90 8.27±0.71 36.0±4.8 0.39±0.1

2.2 各組大鼠腎組織病理學變化 顯微鏡下顯示，對照組大鼠腎臟的組織形態結構變化不明顯;誘導組表現為近端腎小管上皮細胞刷狀緣脫落、壞死、胞質空泡變性，腎小管壞死，管腔內可見蛋白管型及紅細胞管型;干預組大鼠病變較誘導組輕。見圖1～3。

圖1 對照組大鼠腎組織病理學變化(HE，×400)

圖2 誘導組大鼠腎組織病理學變化(HE，×400)

圖3 干預組大鼠腎組織病理學變化(HE，×400)

2.3 各組大鼠腎組織損傷程度的分析比較 結果見表2。與對照組比較，誘導組和干預組腎小管壞死、上皮細胞空泡變性、間質炎性細胞浸潤程度輕(P均＜0.05);與干預組比較，誘導組腎小管壞死、上皮細胞空泡變性、間質炎性細胞浸潤程度重(P均＜0.05)。

表2 各組大鼠腎小管壞死、空泡細胞空泡變性及間質細胞浸潤程度比較(只)

2.4 各組大鼠腎組織GSH、MDA、SOD活性比較結果見表3。

3 討論

GEN是一種臨床上廣泛使用的氨基糖苷類抗生素，因其具有耳腎毒性，在臨床應用受到限制，目前對其引起腎損傷確切機制仍不明確［6］。近年研究［7，8］表明，ROS 釋放、脂質過氧化及炎癥介質釋放是GEN引起腎毒性的主要因素。氨基糖甙類抗生素誘導的腎小管細胞損傷發病機制為溶酶體、線粒體等細胞膜結構改變。氧自由基能攻擊生物膜磷脂中的多聚不飽和脂肪酸，引發脂質過氧化，同時脂質過氧化產生的自由基和醛類丙二醛均具有直接細胞毒性作用，造成生物膜損傷，影響細胞的功能［9］。GSH氧化還原循環系統是細胞內最重要的抗氧化系統之一，而GSH和SOD是該循環系統中最重要的兩種化合物，SOD是體內最重要的抗氧化酶，對于維持細胞的完整性，參與細胞代謝有重要意義，腎組織中GSH和SOD的消耗可直接反映腎組織氧化損傷程度［10，11］。MDA是由自由基產生的脂質過氧化代謝產物，引起脂質過氧化作用，形成脂質過氧化物主要成分，MDA含量可以反映體內脂質過氧化程度，已普遍用作檢測機體組織中氧化應激水平的指標，所以同時檢測MDA含量和SOD，GSH活性可了解自由基產生和抗氧化系統的功能狀態［12］。

表3 各組大鼠腎組織GSH、MDA、SOD活性比較(± s)

表3 各組大鼠腎組織GSH、MDA、SOD活性比較(± s)

注:與對照組比較，*P ＜0.05;與誘導組比較，ΔP ＜0.05

組別 GSH(μmol/g) MDA(nmol/g) SOD(U/mg)誘導組 59.6± 4.5 97.4±14.6* 107.2±9.2*干預組 69.2± 6.8*Δ 48.8± 4.5*Δ 133.9±5.1*Δ對照組 112.5±12.5*38.9± 5.7 158.1±4.2

最近研究［13，14］表明，PPAR-γ 激動劑，在體外和在體內表現出抗炎作用。PPAR-γ激動劑減少炎癥細胞因子的分泌如TNF-α和IL-1b，抑制巨噬細胞的激活。本研究顯示，誘導組、干預組大鼠24 h尿量高于對照組，表明存在GEN誘導大鼠產生多尿;而干預組大鼠24 h尿量低于誘導組，提示RSG對急性腎小管壞死的保護性作用。本研究還發現，誘導組、干預組尿素氮、肌酐較對照組升高，提示GEN可使腎功能發生損害;而干預組尿素氮、肌酐較誘導組降低，提示RSG能通過保留腎細胞的結構完整性，降低血清尿素氮和肌酐水平。本研究誘導組大鼠ROS、MDA水平較對照組升高，SOD水平較對照組降低，且同時發現誘導組大鼠腎小管上皮細胞局灶性顆粒空泡變性，上皮壞死及脫落，小管腔中出現顆粒狀碎屑，表明誘導組腎組織氧化還原系統受損，且受損部位主要位于腎小管，推測GEN引起的腎功能損害與氧自由基代謝失衡，ROS代謝產物增加引起氧化應激有關，目前一些抗氧化劑已被用來防止GEN 腎毒性［15］。

總之，RSG對氧化應激所致的急性腎損傷有保護作用，其機制可能與上調GSH、SOD水平及下調MDA水平有關。

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