UV照射和MMS誘導(dǎo)下PCNA表達(dá)的變化及相關(guān)研究＊

謝穎穎，湯冬娥，劉小會(huì)，高學(xué)娟，劉朗夏

(暨南大學(xué) 功能蛋白質(zhì)研究廣東普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生命與健康工程研究院，廣東 廣州 510632)

0 引言

自然界中的生命體處在一個(gè)動(dòng)態(tài)的生活環(huán)境中，隨時(shí)都有可能受到周圍環(huán)境及自身不利因素的影響。許多的物理因素如紫外線(UV)、各種射線、化學(xué)試劑以及細(xì)胞自身生理活動(dòng)產(chǎn)生的活性氧等都可以使細(xì)胞的基因組DNA產(chǎn)生變異，導(dǎo)致基因損傷，最終可能致使細(xì)胞無(wú)法進(jìn)行正常的生命活動(dòng)［1］。然而，生命體對(duì)于各種的DNA損傷有不同的應(yīng)對(duì)及調(diào)控機(jī)制，其中涉及許多基因和蛋白質(zhì)。細(xì)胞增殖核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA)是真核細(xì)胞中一種分子量為36 kD的蛋白質(zhì)，為DNA聚合酶δ和polε的輔助蛋白，作為DNA復(fù)制的必需因子之一，同時(shí)參與了DNA損傷修復(fù)過(guò)程及細(xì)胞周期的調(diào)控［2］。

UV照射主要形成嘧啶二聚體(CPD)和6－4光產(chǎn)物，細(xì)胞主要通過(guò)核苷酸切除(Nucleotide Excision Repair，NER)進(jìn)行DNA修復(fù);MMS(甲磺酸甲酯)是典型的甲基化試劑，可以使細(xì)胞發(fā)生DNA雙鏈斷裂(Double Strand Break，DSB)［3］。UV 與 MMS 的作用機(jī)理有一定的相似性。關(guān)于 PCNA泛素化的研究多采用紫外線照射損傷為模型，并且多集中于探討 PCNA泛素化在募集錯(cuò)配傾向DNA聚合酶以及在跨損傷復(fù)制中的作用。

最近研究結(jié)果表明，當(dāng)UV照射細(xì)胞后PCNA賴氨酸164(K164)位點(diǎn)可被泛素蛋白識(shí)別進(jìn)行泛素化修飾，這種修飾使PCNA募集跨損傷修復(fù)DNA聚合酶參與損傷應(yīng)答，提高細(xì)胞對(duì)損傷的耐受力［4］。據(jù)報(bào)道有相當(dāng)數(shù)量的酶及蛋白因子可能參加了此應(yīng)答過(guò)程，但是大多數(shù)還不清楚［5］。我們使用 UV和MMS處理細(xì)胞，構(gòu)建DNA損傷模型，在蛋白水平和mRNA水平研究PCNA的表達(dá)變化情況，利用ShRNA干擾技術(shù)，干擾兩個(gè)泛素E3連接酶 RAD18和CUL4A在細(xì)胞中的表達(dá)，研究其對(duì)PCNA蛋白表達(dá)的影響，從而進(jìn)一步研究PCNA蛋白的穩(wěn)定性與其參與DNA損傷修復(fù)之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)主要儀器

RT-PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，凝膠成像掃描系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)，垂直電泳槽(美國(guó)Bio-Rad公司)，瓊脂糖水平電泳儀(北京市六一儀器廠)，高速冷凍離心機(jī) (德國(guó)Eppendorf公司)，熒光顯微鏡(奧林巴斯公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)主要材料

人胚腎T細(xì)胞293T和人宮頸癌細(xì)胞HeLa購(gòu)自中科院細(xì)胞庫(kù)，質(zhì)粒pcDNA-FLAG-PCNA由美國(guó)斯克利普斯研究院的Clare H.McGowan教授惠贈(zèng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

BCA測(cè)定蛋白濃度試劑盒、ECL底物發(fā)光液試劑盒均購(gòu)自碧云天公司;MMS購(gòu)自Sigma公司;轉(zhuǎn)染試劑 Lip2000、DMEM和 Trizol購(gòu)自 Invitrogen公司;胎牛血清、雙抗購(gòu)自 鼠源單抗、β-Actin鼠源單抗購(gòu)自Santa Cruz公司;山羊抗小鼠IgG購(gòu)自Proteintech Group公司;重組DNA酶和Q-PCR引物購(gòu)自TaKaRa公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒和Q-PCR試劑盒購(gòu)自Bio-Rad公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染(轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)) 人胚腎T細(xì)胞293T細(xì)胞和人宮頸癌細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，放置37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)，用0.25%胰酶消化傳代，每2～3天傳代一次。六孔板中，每孔接種5*105/mL細(xì)胞密度，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行轉(zhuǎn)染(貼壁密度 30～50%)。將野生型質(zhì)粒FLAG-PCNA用250 μL DMEM培養(yǎng)液(不含血清和雙抗)室溫混勻5 min，再用250 μL DMEM培養(yǎng)液(不含血清和雙抗)室溫分別混勻兩管 Lipo2000 轉(zhuǎn)染試劑，3.5 μL/管，5 min 靜置，將Lipo2000懸液和質(zhì)粒懸液均勻混合，室溫靜置孵育30 min后，將 DNA復(fù)合物加入細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，4～6小時(shí)后更換成含有10%胎牛血清及雙抗的DMEM全培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)24、48小時(shí)。對(duì)應(yīng)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率用pEGFP-N1空載表達(dá)的綠色熒光蛋白GFP檢測(cè)，用量和比例與構(gòu)建的重組質(zhì)粒相同，轉(zhuǎn)染24、48小時(shí)后在熒光顯微鏡488 nm激光波長(zhǎng)下，觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。

1.4.2 細(xì)胞收集與蛋白樣品準(zhǔn)備 胰酶消化細(xì)胞后，1000 r/min離心3分鐘，PBS清洗2～3次。棄除殘余上清后，用 100 μL EBC裂解液 +PMSF(1∶100)+Protein inhibitor(1∶50)吹打均勻細(xì)胞后，冰浴30分鐘裂解。隨后，12000 r/min、4℃、10分鐘離心留取上清作為全細(xì)胞裂解液，利用BCA法測(cè)定蛋白濃度。

1.4.3 Western blot驗(yàn)證 利用 SDS-PAGE，將30 μg蛋白樣品進(jìn)行電泳并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1小時(shí)，加入鼠源PCNA單克隆抗體(1∶1000)4℃孵育過(guò)夜;TBST清洗三次后，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鼠二抗(1∶2000)室溫孵育1 h;TBST清洗三次后，加入ECL底物發(fā)光液，利用膠片進(jìn)行顯影。β-Actin和FLAG以同樣的稀釋濃度和實(shí)驗(yàn)流程，在同一張膜上進(jìn)行顯色。

1.4.4 RAD18和 CUL4A ShRNA 干擾 ShRNA CUL4A:CCGGGCAGAACTGATCGCAAAGCATCTCGA GATGCTTTGCGATCAGTTCTGCTTTTT;ShRNA RAD18:GAGCATGGATTATCTATTCAA。帶GFP標(biāo)簽的干擾質(zhì)粒由吉瑪公司構(gòu)建合成，用Lipo2000轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染72 h后，收集細(xì)胞1000 r/min離心3分鐘，PBS清洗2～3次。

1.4.5 RNA 提取和逆轉(zhuǎn)錄生成 cDNA Trizol法提取細(xì)胞總RNA，加入重組DNA酶去除DNA后，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄生成，反應(yīng)體系與條件如下:

反應(yīng)條件:

1.4.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Q-PCR) 將生成cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，引物設(shè)計(jì)采用Primer Primer 5.0軟件(見(jiàn)表1)，送至TaKaRa公司合成。

表1 目的基因引物Tab.1 Primers of target genes

Q-PCR反應(yīng)體系:

反應(yīng)條件:

運(yùn)用Bio-rad CFX Manager系統(tǒng)軟件，顯示相關(guān)PCR相關(guān)結(jié)果和參數(shù)。選用ACTB和GAPDH為內(nèi)參，校正差異。mRNA的差異用ΔCt值計(jì)算表示，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次后，計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)方差。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 UV照射和MMS處理對(duì)內(nèi)源PCNA蛋白水平表達(dá)及細(xì)胞形態(tài)的影響

Hela細(xì)胞經(jīng) UV照射(1 min)和 MMS處理(1 μmol/L)后，繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，在不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，利用Western blot檢測(cè)蛋白質(zhì)水平的變化。結(jié)果顯示細(xì)胞內(nèi)源PCNA的表達(dá)沒(méi)有發(fā)生明顯的變化(圖1A)。而細(xì)胞形態(tài)有明顯的變化，隨著UV照射，細(xì)胞在3 h開(kāi)始出現(xiàn)漂浮壞死細(xì)胞，6 h后貼壁細(xì)胞大量減少、死亡增加，12 h后基本全部死亡。MMS處理細(xì)胞3hr后，貼壁能力開(kāi)始降低，接近12 h時(shí)，細(xì)胞皺縮呈懸浮狀態(tài)。

圖1 UV照射和MMS處理對(duì)內(nèi)源PCNA蛋白水平表達(dá)(A)及細(xì)胞形態(tài)的影響(B)。A.Western blot檢測(cè)HeLa細(xì)胞中PCNA蛋白的表達(dá);B.倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化Fig.1 The protein expression levels of endogenous PCNA(A)and cell morphology(B)after UV irradiation and MMS treatment.A.Western blot analysis of PCNA protein levels in HeLa cells;B.Changes in cell morphology was observed using an inverted fluorescence microscope.

2.2 UV照射對(duì)外源表達(dá)FLAG-PCNA蛋白表達(dá)的影響

在Hela細(xì)胞中轉(zhuǎn)染野生型的FLAG-PCNA質(zhì)粒，在轉(zhuǎn)染42 h后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行UV照射1 min，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞6 h后收集細(xì)胞，利用 Western blot檢測(cè)FLAG-PCNA蛋白質(zhì)水平的變化。結(jié)果顯示，當(dāng)UV照射細(xì)胞時(shí)，F(xiàn)LAG-PCNA蛋白表達(dá)差異不明顯(圖2)。

圖2 UV照射對(duì)外源表達(dá)FLAG-PCNA蛋白表達(dá)的影響Fig.2 The effect of UV irradiation on expression of exogenous FLAG-PCNA protein

2.3 UV照射和MMS處理對(duì)內(nèi)源PCNA mRNA水平的影響

Hela細(xì)胞經(jīng)UV照射后，提取等量的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)間接反映PCNA和GAPDH(內(nèi)參)mRNA含量的變化情況。如圖3A所示，觀察到特異性的PCNA和GAPDH擴(kuò)增條帶，在UV照射下，GAPDH的mRNA含量無(wú)明顯變化，而PCNA的mRNA表達(dá)量明顯降低。然后，我們又利用Q-PCR技術(shù)檢測(cè)DNA損傷時(shí)，PCNA的mRNA水平變化情況。如圖3B所示，Hela細(xì)胞經(jīng)UV或MMS處理3小時(shí)后，PCNA的mRNA表達(dá)量急劇下降，到達(dá)一個(gè)穩(wěn)定期，在處理6小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)，無(wú)明顯的再下降。

2.4 敲除 E3連接酶 RAD18或 CUL4A對(duì)內(nèi)源PCNA蛋白表達(dá)的影響

將RAD18或CUL4A的shRNA干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞72 h，收集細(xì)胞，利用Western blot檢測(cè)內(nèi)源PCNA的表達(dá)變化。如圖4A和B所示，利用QPCR的方法檢測(cè)到RAD18或CUL4A的shRNA明顯降低了二者的表達(dá)量。與對(duì)照組相比，干擾RAD18或CUL4A的表達(dá)以后，PCNA的蛋白表達(dá)量均增加(圖4C)，說(shuō)明E3連接酶RAD18和CUL4A均參與了PCNA的泛素化降解過(guò)程。

圖3 UV照射和MMS處理對(duì)PCNA mRNA水平的影響。A.常規(guī)PCR后產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果;B.UV照射和MMS處理細(xì)胞后進(jìn)行Q-PCR檢測(cè)，結(jié)果為三次獨(dú)立的重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.3 The effects of UV irradiation and MMS treatment on PCNA mRNA levels.A.Agarose gel electrophoresis analysis of the products of conventional PCR;B.Real-time fluorescence quantitative PCR analysis after UV irradiation and MMS treatment.The experiments were independently repeated three times

圖4 敲除E3連接酶RAD18或CUL4A對(duì)內(nèi)源PCNA蛋白表達(dá)的影響。A.Q-PCR檢測(cè)RAD18的mRNA表達(dá)水平;B.Q-PCR檢測(cè)CUL4A的mRNA表達(dá)水平;C.Western blot檢測(cè)PCNA蛋白的表達(dá)水平Fig.4 Effects of knockdown of E3 ubiquitin ligase RAD18 or CUL4A on the endogenous expression of PCNA protein levels.A.Q-PCR analysis of RAD18 mRNA levels;B.Q-PCR analysis of CUL4A mRNA levels;C.Western blot analysis of PCNA protein levels

3 討論

從以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察到當(dāng)UV照射和MMS處理后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，大部分細(xì)胞都趨于死亡，說(shuō)明細(xì)胞中損傷的DNA未能得到及時(shí)有效的修復(fù)，這可能與UV的劑量和MMS的處理時(shí)間有關(guān)系［6，7］。但UV照射細(xì)胞后，內(nèi)源和外源的PCNA蛋白水平的表達(dá)都沒(méi)有明顯的變化，說(shuō)明細(xì)胞中存在著一定的修復(fù)機(jī)制，使得PCNA的穩(wěn)定性得到保護(hù)。隨后通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)PCNA的mRNA水平反而下降，說(shuō)明在DNA損傷時(shí)PCNA蛋白的穩(wěn)定性增加，參與DNA損傷修復(fù)。

據(jù)報(bào)道，泛素連接酶RAD18可以增加PCNA的泛素化，是人體細(xì)胞內(nèi)DNA損傷旁路機(jī)制所必需的成分［8］。CUL4A是E3連接酶核心結(jié)構(gòu)中的主要骨架，能夠通過(guò)UPS介導(dǎo)蛋白降解，從而使細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)蛋白水平及功能得到調(diào)控。因此，在DNA損傷的情況下，研究這兩個(gè)E3泛素連接酶對(duì)PCNA的影響是十分必要的。我們的結(jié)果證明使用shRNA干擾E3連接酶CUL4A和RAD18表達(dá)，PCNA蛋白水平升高，說(shuō)明它們與PCNA的降解過(guò)程有關(guān)。這些結(jié)果將有助于深入研究 PCNA蛋白的穩(wěn)定性與其參與DNA損傷修復(fù)之間的關(guān)系以及DNA復(fù)制與損傷修復(fù)調(diào)制機(jī)制。

研究DNA損傷與修復(fù)有利于了解基因突變機(jī)制、衰老和癌變的原因，可應(yīng)用于環(huán)境致癌因子的檢測(cè)。Liu等的研究表明，在鎘污染環(huán)境中生長(zhǎng)的擬南芥苗中，PCNA的含量明顯升高，表明PCNA也可作為一種監(jiān)控鎘污染和環(huán)境污染的分子標(biāo)記物［9］。此外，在人體內(nèi)，由于終末分化細(xì)胞的 PCNA表達(dá)水平通常較低，而在許多常見(jiàn)的癌癥細(xì)胞內(nèi)PCNA的表達(dá)水平都顯著增高［10，11］;因此，研究 PCNA 的表達(dá)水平變化對(duì)于揭示其參與細(xì)胞功能的分子機(jī)制至關(guān)重要。

［1］向生光，胡維新.增殖細(xì)胞核抗原PCNA在DNA修復(fù)中的作用［J］.生命的化學(xué)，2009，29(4):472-476.XIANG Shengguang，HU Weixin.Role of PCNA in DNA repair［J］.Chemistry of Life，2009，29(4):472-476.

［2］HENDEL A，KRIJGER P H，DIAMANT N，et al.PCNA ubiquitination is important，but not essential for translesion DNA synthesis in mammalian cells ［J］. PLoS Genet， 2011， 7(9):e1002262.

［3］GALI H，JUHASZ S，MOROCZ M，et al.Role of SUMO modification of human PCNA at stalled replication fork［J］.Nucleic Acids Res，2012，40(13):6049-6059.

［4］GENING L V，TARANTUL V Z.Involvement of DNA polymerase iota in hypermutagenesis and tumorigenesis:an improper model can lead to inaccurate results［J］.Immunol Lett，2006，106(2):198-199.

［5］HOEGE C，PFANDER B，MOLDOVAN G L，et al.RAD6-dependent DNA repair is linked to modification of PCNA by ubiquitin and SUMO［J］.Nature，2002，419(6903):135-141.

［6］NORBURY C J，ZHIVOTOVSKY B.DNA damage induced apoptosis［J］.Oncogen，2004，23(16):2797-2808.

［7］PFEIFER G P，YOU Y H，BESARATINIA A.Mutations induced by ultraviolet［J］.Mutat Res，2005，571(1-2):19-31.

［8］胡恭華，李鋒，莊志雄，等.氫醌誘導(dǎo)下肝細(xì)胞 PCNA、RAD6B及RAD18基因mRNA表達(dá)的時(shí)間效應(yīng)［J］.中國(guó)工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志，2009，22(2):83-86，90.HU Gonghua，LI Feng，ZHUANG Zhixiong，et al.Study on time-effect of PCNA，RAD6B and RAD 18 mRNA expression induced by hydroquinone in L-02 hepatic cells［J］.Chinese J Ind Med，2009，22(2):83-86，90.

［9］ LIU W，YANG Y S，F(xiàn)RANCIS D，et al.Cadmium stress alters gene expression of DNA mismatch repair related genes in Arabidopsis seedlings［J］.Chemosphere，2008，73(7):1138-1144.

［10］ SHEN S Q，LI K，ZHU N，et al.Expression and clinical significance of NET-1 and PCNA in hepatocellular carcinoma［J］.Med Oncol，2008，25(3):341-345.

［11］ WANG Y Z，CAO Y Q，WU J N，et al.Expression of nitric oxide synthase in human gastric carcinoma and its relation to p53，PCNA ［J］.World J Gastroenterol，2005，11(1):46-50.