視黃酸促進限定性內胚層細胞向胰腺前體細胞分化＊

李 進，賀菁菁，林 戈，盧光琇*

(1.中南大學生殖與干細胞研究所，湖南 長沙 410078;2.人類國家干細胞工程研究中心，湖南 長沙 410078)

人胚胎干細胞具有自我更新和多向分化的潛能，在體外內能經由限定性內胚層細胞，原始腸管，誘導分化獲得胰腺前體細胞。經歷原始腸管尾端化以后，隨后的細胞類型的特化并不是隨機進行的，某些特定信號如RA信號及BMP信號調控調控細胞朝著肝臟、胰腺、消化道等多個人體重要的組織器官分化。FGF10在胚胎胰腺間充質細胞中表達，作為微環境能有效的促進胰腺上皮細胞的增殖［1，2］。IndolactamV是蛋白激酶C同工酶的抑制劑，最近研究發現它能增加表達pdx1基因的胰腺原基細胞數目［3］。并且聯合 indolactamV和 FGF10能提高 pdx1陽性細胞的比率［2］。在原始腸管階段后，BMP信號促進細胞向肝臟的進一步分化［4］，所以想要獲得更多的胰腺前體細胞，抑制BMP信號是有效的方式，dorsomorphin是通過阻斷BMP調節SMAD1/5/8磷酸化起到抑制BMP信號的作用，文獻報道能有效地抑制BMP信號通路促進胚胎干細胞向神經細胞誘導［5］。有研究表明RA信號在胚胎內胚層向早期胰腺發育中起著重要作用，因此RA用于胰島素分泌細胞的誘導策略中。在小鼠ES細胞誘導中，在EB形成的D4加入RA能促進內胚層細胞的定向分化［6］。Noggin，RA和FGF協調作用可以調節內胚層向肝胰分化［7］。另外，Actinvin A聯合RA作用通過三步法可以獲得胰島素分泌細胞［8］，上述研究顯示 RA在胰腺的內胚層的決定和胰腺誘導中起到重要作用，目前對于RA誘導的最佳開始時間和持續時間尚無明確報道;因此了解最佳的RA作用時期，是限定性內胚層向胰腺前體細胞誘導策略中的重要環節。本實驗利用自主建系的人胚胎干細胞系為材料，研究RA在限定性內胚層向胰腺前體細胞分化過程中的最佳作用時間窗，為深入研究人胚胎干細胞體外誘導分化為更成熟的胰島素分泌細胞奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 人類胚胎干細胞培養

chHES137，chEHS26 為本實驗室自主建系［9］，核型正常，P20～P30用于實驗。CF1成纖維細胞做為飼養層細胞，培養基:基礎培養基DMEM/F12，15%SR、0.1 mmol/L β-ME、2 mmol/L L-Glu、4 ng/mL bFGF、1%非必需氨基酸。細胞每5-7天傳代一次，用于實驗的人胚胎干細胞轉到Matrigel預鋪皿的培養板上，使用條件培養基培養，生長3-5天后開始誘導實驗。

1.2 誘導因子

試驗中用的培養基和誘導因子如下:DMEM/F12、FBS、RPMI1640為 Invitrogen公司產品，Activin A、Wnt3a、KGF、FGF10購自 R＆D 公司;dorsomorphin、indolactamV購自Stemgent公司;AFP單克隆抗體購自sigma公司、PDX1單克隆抗體購自 R＆D公司;RA(視黃酸)購自sigma公司。

1.3 胰腺前體細胞誘導

從人胚胎干細胞誘導獲得胰腺前體細胞分為三個階段，第一階段為限定性內胚層細胞的誘導(d0-d3)，在無飼養層體系上培養的人胚胎干細胞匯合度到80%左右開始實驗，用DPBS洗2遍，換RPMI1640培養基，添加100 ng/mL ActivinA(A)和25 ng/mL Wnt3a(W)共同作用一天，接下來ActivinA持續作用2天誘導限定性內胚層細胞［10］。第二階段為原始腸管細胞誘導(d3-d6)，添加25 ng/mL KGF和2%FBS作用3天獲得原始腸管細胞［11］。第三階段為胰腺前體細胞的分化(d6-d10)，聯合 FGF10、dorsomorphin(Dor)、indolactamV(ILV)共同作用4天誘導胰腺前體細胞。根據RA的作用時間窗口，RA的作用方式分為四個組:不加RA組，d3-d6加RA組;d6-d10加RA組;以及d3-d10加RA組。

1.4 免疫熒光染色

收集不同實驗組的在d10天的細胞，進行pdx1和afp抗體的免疫熒光染色，并用DAPI復染細胞核。方法如下:收集的細胞用PBS快速清洗三遍，加4%的多聚甲醛溶液室溫下固定細胞15 min，加PBS清洗3遍;加封閉液(PBS中添加10%驢血清、0.1%的triton-X-100和1%BSA)封閉30 min，加 PBS清洗3遍;加一抗(小鼠抗人AFP單克隆抗體，1∶500稀釋;山羊抗人PDX1單克隆抗體，1∶200稀釋)，4℃過夜孵育，次日加PBS清洗3遍;加熒光二抗(驢抗羊A-lexis 594，1∶1000;驢抗小鼠 Alexis 488，1∶1000)室溫避光孵育1 h，用 PBS清洗3遍;加 DAPI(1∶1000稀釋)染核，室溫避光孵育5 min，用PBS清洗3遍;熒光顯微鏡下觀察結果。熒光顯微鏡為日本Nikon公司產品。陽性細胞計數:隨機選取10個顯微鏡視野，平均每個視野下約200個細胞，共計數2000個細胞，計算陽性細胞總數和比例。實驗數據采用SPSS13.0軟件使用t檢驗進行統計數據分析，所有的結果重復三次。

1.5 聚合酶鏈式反應(RT-PCR)

收集誘導各個階段的細胞以及RA不同處理組在d10天的細胞，使用TRIZOL試劑(invitrogen)抽提總RNA，并用隨機引物和逆轉錄試劑盒(Promega)合成cDNA，起始的總RNA定量到1 μg，所有的聚合酶鏈式反應都使用Tag DNA聚合酶，在不同的反應溫度和循環次數下，總的反應體系為10 μL，PCR產物在2%的瓊脂糖凝膠上分離并用溴化乙錠染色。引物序列和對應基因片段大小請見表1。

表1 RT-PCR的引物序列Tab.1 Primers for RT-PCR

2 結果

2.1 人胚胎干細胞向胰腺前體細胞分化體系的建立

Pdx1作為胰腺前體細胞特有標記［12］，可以用來指示胰腺的特化。經歷原始腸管后，聯合FGF10、dorsomorphin、indolactamV共同作用4天誘導胰腺前體細胞，在d10天免疫組化結果顯示，三個因子共同作用能獲得pdx1陽性細胞，但是同時也獲得了AFP陽性細胞，并且兩種標記的并不重合(圖1)。RTPCR結果顯示在限定性內胚層階段和原始腸管階段均沒有pdx1和afp的表達;而在胰腺特化4天后，誘導獲得的細胞開始表達pdx1和afp。AFP作為早期肝臟前體細胞的標記，以上結果說明在獲得胰腺前體細胞的同時，也有部分細胞朝著肝臟前體細胞特化。

2.2 RA持續作用能有效的促進pdx1表達并且同時抑制afp表達

為了了解RA能否增強pdx1的表達以及能否抑制AFP的表達，d10天檢測4組細胞的pdx1和AFP結果顯示，就pdx1陽性比率而言，結果為d3-d10RA組＞d6-d10RA組 ＞NO RA組 ＞d3-d6RA組;對于afp的陽性比率，NO RA組＞d6-d10RA組＞d3-d6RA組＞d3-d10RA組(圖2);兩者的結果說明RA的引入并在d3到d10天持續作用，在促進pdx1表達的同時并且能同時抑制afp的表達，能更加有效的促進內胚層前體細胞向胰腺前體細胞分化。RT-PCR檢測pdx1和afp在四組中的表達情況，結果顯示與免疫組化技術的結果有相似的趨勢，RA持續作用組可以獲得最高的pdx1和最低的afp基因表達(圖3)。

圖1 誘導10天后檢測pdx1(紅色)和afp(綠色)的表達Fig.1 The expression of pdx1(red)and gfp(green)on d10 in pancreatic precursor induction

2.3 RA持續作用條件下，RA作用到d9天是最佳的作用時間

圖2 RA不同作用時間下在d10天pdx1和afp陽性細胞比率變化趨勢圖Fig.2 Trend line chart of percentage of pdx1 and afp positive cells in different groups on d10

圖3 不同RA作用組在d10天pdx1和afp檢測的RT-PCR結果Fig.3 The expression of pdx1 and afp on d10 in different groups by RT-PCR

既然RA在d3到d10持續作用能有效的促進pdx1的表達，那么是什么樣的胰腺前體細胞最適合用于朝向胰島素分泌細胞誘導分化。我們分別在持續作用組的d7;d8;d9;d10四個時間點，通過免疫組化檢測 pdx1的陽性比率(圖 3)。結果顯示，d9(52.1±1.2%)＞d8天(46.3±1.9%)＞d10天(40±1.3%)＞d7天(37±1.8%);pdx1的表達經歷了由d7到d9天的上升過程，從d9到d10pdx1的表達開始減弱，在誘導的d9天達到峰值，也就是說在d9天能獲得最多的胰腺前體細胞，所以d9也是由胰腺前體細胞朝向胰島素分泌細胞誘導分化的最佳時間點。

3 討論

人胚胎干細胞向胰腺前體細胞以及胰島素分泌細胞誘導分化，過程中需要像 Wnt，shh和 EGF［13-15］等很多的信號分子分階段參與調控。聯合FGF10、dorsomorphin、indolactam V共同作用4天可以獲得同時pdx1和afp陽性細胞，而且兩者的染色結果并不重疊。說明內胚層前體細胞同時啟動了向胰腺前體和肝臟前體的分化，BMP信號參與到胰腺和肝臟前體細胞的調控分化［16］。因此我們在追求胰腺前體陽性細胞比率的同時還需要抑制內胚層細胞在這一過程向其他類型細胞分化，顯然單獨的dorsomorphin抑制BMP的表達并沒有完全起到這樣的效果。

早期研究關注RA能促進神經細胞的成熟和抑制細胞增殖［17］。在非洲蟾蜍上的研究顯示RA在原腸形成的過程中調節內胚層的形成［18，19］。不只是在內胚層特化過程中，RA在向胰腺特化過程中起著重要作用［20］，RA能有效的促進pdx1陽性細胞的比率［21］。所有結果顯示RA在內胚層特化和胰腺前體特化過程中都起到作用。也有研究表明RA在胰腺特化過程中能起到抑制AFP的作用［22］。因此在限定性內胚層細胞向胰腺前體細胞誘導分化過程中，RA到底需要以什么樣的方式起作用才能效果最佳值得探討。結果中，從內胚層開始到胰腺前體細胞誘導過程中，只有RA一直作用才能有效的促進pdx1的表達并抑制afp的表達，并且在作用的d9天能取得最高比率的pdx1陽性細胞。這一結果和前面在模式生物的實驗結果相吻合，說明人胚胎干細胞在體外能夠較好的重復體內發育過程。因此通過在體外模擬胰腺β細胞發育規律最終獲得胰島素陽性細胞，人胚胎干細胞能作為治療糖尿病的理想的種子細胞。

圖4 RA持續作用條件下pdx1陽性細胞比率在不同時間點變化情況Fig.4 The expression of percentage of pdx1 positive cells at different time with RA

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