擬南芥高絲氨酸激酶HSK的分子結構與同源建模研究＊

肖文君，胡 帥，曾 榮，常洪平，袁聰穎，王 萍，張 騁，陸秀濤，郭新紅*

(1.湖南大學生物學院 植物功能基因組學與發育調控湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410082;2.湖南大學金融與統計學院，湖南 長沙 410079)

高絲氨酸激酶(Homoserine kinase)、半乳糖激酶(Galactokinase)、甲羥戊酸激酶(Mevalonate kinase)和磷酸甲羥戊酸激酶(Phosphomevalonate kinase)均為GHMP激酶超家族的代表性成員。該家族成員參與一些重要的新陳代謝過程，如醣酵解、氨基酸生物合成和甾醇生物合成等［1-5］。在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中，高絲氨酸激酶(EC2.7.1.39，HSK)由位于2號染色體上的AT2G17265單基因編碼而成，催化L-高絲氨酸磷酸化，參與甲硫氨酸和蘇氨酸的生物合成。此外，該基因還可介導一種因高絲氨酸在葉綠體中積累而觸發的新型植物抗病形式［6］。這種抗性形式不同于已知的免疫反應，但其分子機制還有待研究。擬南芥中的HSK與在細菌、真菌體內合成的HSK發生同源，雖然它們序列相似性較低，但三維結構非常類似［7］。目前，關于GHMP激酶超家族成員HSK的分子結構與同源建模方面的研究尚未見報道。在本文中，筆者利用生物信息學方法，從分子水平對高絲氨酸激酶的基本特性和三維結構進行研究，為進一步解析HSK的作用機理和高級結構提供科學依據和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 數據來源

在擬南芥信息資源網站(http://www.arabidopsis.org/)上查找高絲氨酸激酶HSK信息，并以FASTA格式下載其蛋白質序列，登錄號為AT2G1726;于PDB網站查找HSK晶體結構信息，以FASTA格式下載IFWL.A晶體的序列信息，以ENT或PBD格式下載晶體結構文件。

1.2 HSK一級結構分析

利用DNAMAN軟件分析HSK的分子質量、等電點及氨基酸組成;使用ProtParam工具預測不穩定系數(II)、脂肪族系數(AI)和半衰期;使用ProtScale程序進行疏水性分析。

1.3 HSK二級結構分析

利用NPS程序分析HSK的二級結構域;使用SignalP3.0程序預測信號肽結構;使用TMpred程序預測跨膜結構域;使用Epestfind程序預測PEST結構;使用PSORT程序預測HSK的亞細胞定位。

1.4 HSK三級結構分析

利用SWISS-MODEL進行同源建模，用Chimera(V1.8.1)軟件進行結構優化并顯示分子三維結構，使用Molprobity4及ERRAT(V 2.0)對建模結果進行結構質量評估。

2 結果與分析

2.1 HSK一級結構分析

HSK由370個氨基酸殘基組成，相對分子質量為38521.4，預測等電點 pI=8.48，呈弱堿性。HSK由20種L-氨基酸構成，其中甘氨酸(Ala)的含量最高，達到12.97%，色氨酸(Trp)與酪氨酸(Tyr)含量最低，分別只占0.54%和0.81%;非極性氨基酸占51.61%，酸性氨基酸占 8.91%，堿性氨基酸占11.35%(圖 1)。

圖1 HSK的氨基酸組成Fig.1 Amino acid compositions of HSK

利用ExPASY網站的ProtParam工具預測HSK的基本特性;預測結果顯示，HSK的不穩定系數II=34.03，屬于穩定蛋白質;脂肪族系數 AI=98.35，平均親水性(GRAVY)0.267;在不同物種的體細胞內，HSK的半衰期也不盡相同:在哺乳動物的網織紅細胞中半衰期達30 h，在酵母和大腸桿菌中，其半衰期分別為＞20 h和＞10 h。

使用ProtScale程序對HSK的疏水性進行分析(圖2)。親水指數(hydropathy index)越大，表明該氨基酸的疏水性越強。在18～22處有一顯著親水區域，200～205及265～271有兩段顯著疏水區域。此外，疏水性氨基酸在25～75及113～160兩端區域分布較為集中，而在205～260這一區域親水性氨基酸分布較為集中，其余區域親疏性氨基酸大致呈均勻分布(圖2)。

圖2 HSK疏水性圖譜Fig.2 Hydrophilicity profiles of HSK

圖3 HSK二級結構分析Fig.3 Secondary structure analysis of HSK

2.2 HSK二級結構分析

利用NPS程序中的HNN算法對HSK的二級結構進行預測分析，結果如圖3。在HSK的370個氨基酸殘基中，有127個氨基酸殘基(34.32%)參與構成不同區域的α-螺旋，178個殘基(48.11%)構成不規則卷曲，65個殘基(17.57%)組成延伸鏈，不含Beta turn、310 helix、Pi helix、Beta bridge 及 Bend region等二級結構。可信度較高的α-螺旋(藍色部分)分布在113～133、151～168、260～269、269～307及 332～345等區域，延伸鏈(紅色部分)分布在40～45、50～55、96～110、203～208、321～326等區域，此外在9～26、138～150、209～224、278～295等區域還存在大量不規則卷曲(紫色部分)(圖3)。

使用SignalP3.0程序的NN算法對HSK前體蛋白的前70個氨基酸殘基進行信號肽預測(圖4)。圖4中C值(紅線)代表剪切位點值，S值(綠線)表示信號肽區域，Y值(藍線)為綜合考慮C值和S值的參數，用于推測信號肽的剪切位點。HSK的信號肽可能由1～16位的氨基酸殘基組成，即“LITCSSMASLCFQS”片段，剪切位點可能位于“PSK*PIS”處(15～20)(圖4)。

使用TMpred程序預測HSK跨膜結構域(圖5)。黑色實線表示由細胞質膜內側向外側延伸(i→o)的跨膜結構，灰色虛線代表相反方向(o→i)的跨膜螺旋，分值大于500的拓撲結構表示具有跨膜顯著性。如圖所示，在145 ～163(o→i)、145 ～168(i→o)、255～277(o?i)、304 ～325(i→o)、307 ～325(o→i)等 5個區域可能存在不同朝向的顯著跨膜結構(圖5)。

圖4 HSK信號肽預測Fig.4 Prediction of signal peptide for HSK

圖5 HSK的跨膜結構預測Fig.5 Prediction of transmembrane topology for HSK

使用Epestfind程序預測HSK的PEST結構(圖6)。檢測閾值設定為+5.00，序列分值越高，表示蛋白質在此處發生降解的可能性越大。有效的PEST結構依據分值高低分為三類:PEST motif(Symboles)、Potential(+++++)、Poor(ooooo)。HSK中可能存在6個PEST結構(poor)，分別位于141～169、302～330、55～82、36～55、223～239和 242～253處(圖6)。

圖6 HSK PEST結構預測Fig.6 Prediction of PEST motif for HSK

使用PSORT(V6.4)程序預測HSK的亞細胞定位，該程序通過檢測蛋白質的膜拓撲結構、特征信號序列、邊界定位序列以及疏水矩等信息來確定蛋白質亞細胞定位。預測結果顯示:HSK定位于葉綠體基質的確定分值為0.887，定位于葉綠體類囊體膜的確定性分值0.593，定位于葉綠體類囊體體腔中的確定分值 0.548。

使用ScanProsite工具預測HSK的翻譯后修飾位點，結果發現，HSK的中可能存在9個PKC磷酸化位點，2個CK2磷酸化位點，8個豆蔻酰化修飾位點，1個酰胺化位點，1個天冬酰胺糖基化位點(257～260，“NSSQ”)，1 個 ATP 結 合 位 點(143 ～154，“LPLGSGLGSSAA”)。

2.3 HSK建模結構分析

目前，預測蛋白質三級結構的方法主要有三種，同源建模法、串線法(折疊識別法)和從頭預測法［8］。蛋白質同源建模是基于序列同源比對的一種建模方法，此法對于序列相似度大于30%的預測模擬較為有效。我們以1FWL.A為模板，利用SWISSMODEL 進行同源建模，再利用 Chimera(V 1.8.1)軟件對初建模型進行結構優化并顯示最終結果，結果見圖 7、8，最后使用 Molprobity4 及 ERRAT(V 2.0)對優化模型進行立體化學質量評估，并給出Ramachandran圖，結果見圖9。

圖7-A展示了主側鏈的空間走向，可清晰地觀察到10個α-螺旋(紅色部分)、12個β-折疊(藍色部分)及多個β-轉角、β-凸起和無規卷曲的空間分布及相對位置;圖7-B為HSK的疏水表面結構，由圖可看觀察到分子表面的基本輪廓、多個疏水凹陷中心以及空穴結構的空間分布。

圖7 HSK的三維結構模擬圖Fig.7 Prediction of 3D structure for HSK

圖8 HSK結構修飾對比圖(灰白色部分為修飾前結構)Fig.8 Comparison of structural modification for HSK(The part colored gray-white is pre-modified structure)

Ramachandran圖，亦稱［φ，ψ］圖，該圖依據分子內非鍵合原子間的最小距離，評估兩個相鄰肽單位的α-碳與酰胺平面交角(φ和ψ)構象是否合理，并分別以φ和ψ為橫，縱坐標在圖中進行標注。該圖通過計算允許區中的氨基酸所占比例來描述蛋白質主鏈碳的φ和ψ所產生的低能構象和分布方式，并大致評估模擬的結構是否與自然結構趨勢相同［9］。φ和ψ最理想的分布區域位于一般允許區，藍線外為不允許區。如果蛋白質中90%以上的二面角位于一般允許區內，說明該結構具有穩定的空間結構［10］。在本次HSK的最終預測模型中，有91.00%的氨基酸殘基位于拉氏構象圖的一般允許區內，98.71%的殘基位于最大允許區以內，結果表明該模型具有穩定的空間構型。此外，筆者還用ERRAT(V 2.0)對模型進行了進一步的結構驗證，測評所得分值為92.905，高于 ERRAT的平均分值91.000分，表明該模型整體構象符合立體化學規則(圖9)。

3 討論

圖9 HSK的拉氏構象圖Fig.9 Ramachandran plot of HSK

蛋白質是由多種α-氨基酸按一定的序列通過肽鍵(酰胺鍵)縮合而成的具有一定功能的生物大分子。為了研究的方便，通常將蛋白質的共價結構和空間構象分為不同層次來描述。多肽鏈中的氨基酸序列即為蛋白質的一級結構(primary structure)，氨基酸序列的多樣性決定了蛋白質空間結構和功能的多樣性。高絲氨酸激酶(HSK)由370個氨基酸殘基組成，非極性氨基酸占51.61%，酸性氨基酸占8.91%，堿性氨基酸占11.35%，預測 pI=8.48，呈弱堿性。蛋白質的酸堿性主要取決于酸/堿性氨基酸的比例以及所處的空間位置和化學環境［11］。HSK為弱堿性蛋白質，這可能不僅是堿性氨基酸在數量上占優勢的表現，更可能與該蛋白質在行使功能時所處的化學環境有關。而聯系前文我們利用PSORT(V6.4)程序來預測HSK的亞細胞定位所得結果來看，似乎也應證了我們的這一猜測。HSK的亞細胞定位最有可能位于葉綠體基質(確定分值為0.887，定位于類囊體膜和類囊體腔的確定分值為別為0.593和0.548);而眾所周知，由于存在跨類囊體膜的H+梯度，所以類囊體腔中的環境呈酸性，pH約為4［12］，葉綠體基質呈微堿性，pH 約為 8［13，14］，而完成卡爾文循環的最適 pH為8.1［12］。所以，縱觀 HSK的酸堿性和亞細胞定位的結果來看，HSK呈弱堿性的氨基酸構成可能是其在特殊離子環境中行使特定功能所必須的。

蛋白質的合成是細胞內一項精密而復雜的活動，這一工程需要經過轉錄、翻譯、加工、修飾及定位等多個步驟在時間和空間上的精確協同，才能最終完成的。擬南芥HSK的編碼基因位于第二條染色體上，而其經轉錄、翻譯后，最終定位于葉綠體。這一過程中，在胞質游離核糖體上可能先進行HSK前體蛋白的合成，待合成完畢后再被釋放到細胞溶膠中(翻譯后轉運途徑)。而HSK靶向葉綠體的前體蛋白的N端極有可能含有一段信號肽，這一信號肽可能通過識別附著于葉綠體被膜上的Toc和Tic復合物，將前體蛋白導入葉綠體中。我們利用SignalP3.0程序的NN算法對HSK前體蛋白的信號肽進行預測的結果(圖4)顯示，信號肽可能由1～16位的“LITCSSMASLCFQS”片段組成，剪切位點可能位于“PSK*PIS”處(15～20)。然而，我們從圖4中還可以觀察到這樣一個信息，在第35～40位上還檢測到一個信號肽預測峰，這一段序列是否也是一段信號肽，在前體蛋白進入葉綠體基質，基質導入序列(the stromal import sequence，可能為1～16位序列)被切割、折疊后，使得35～40片段暴露出來，繼而引導余下多肽鏈進入類囊體，還有待進一步研究。當然，做出這一猜測的前提是HSK有可能定位于類囊體腔中或其膜上。

PEST序列是指富含脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、絲氨酸(S)和蘇氨酸(T)的肽段。根據PEST序列假說而言，含有該序列的蛋白質在細胞內可能通過由蛋白體或鈣蛋白酶介導的途徑進行降解，因而胞內半衰期較短［15］。我們利用 epestfind程序對 HSK的PEST序列的預測結果顯示，在全長為370的HSK中，不存在明顯的PEST序列，因此該蛋白質在胞內應較為穩定。而這一結果與ProtParam的預測不謀而合，在哺乳動物的網織紅細胞中半衰期達30 h，在酵母和大腸桿菌中，其半衰期分別為＞20 h和＞10 h，不穩定系數 II=34.03，屬于穩定蛋白質，并且脂肪系數AI高達98.35。脂肪族系數是指脂肪族氨基酸(丙氨酸，纈氨酸，異亮氨酸和亮氨酸)的側鏈占整個蛋白質的相對體積，它被認為是提高球狀蛋白質熱穩定性的積極因素［16］。

蛋白質空間構象的維持主要依靠氫鍵、疏水作用和范德華力等。在水溶液中，疏水作用作為一種因氨基酸側鏈相互聚集而形成的作用力，減少了非極性殘基與水的相互作用，使水分子的混亂度(熵值)增加，在能量上有利于蛋白質形成特有的空間結構［17］。對蛋白質疏水性進行預測分析有助于幫助我們進一步了解其跨膜結構域和分子表面結構。尤其是分子表面結構，眾所周知，分子表面常有空穴，它是結合配體，行使生物學功能的活性部分，而空穴通常是一個疏水的區域［18］。另一個重要用途是預測膜蛋白在細胞膜中的分布。如果發現膜蛋白有連續二十個左右的氨基酸都具有較強的疏水性，那么很有可能這一段氨基酸是膜蛋白橫跨細胞膜的部分［19］。

我們利用ProtScale程序對HSK的疏水性進行分析，圖2中利用親水指數來對氨基酸的親疏水性進行了量化。氨基酸的親水指數是根據蒸汽至水相轉移的ΔtrGme○值以及在形成蛋白質時氨基酸在表面和內部的分布來測算的，是一個描述氨基酸支鏈的親水性或疏水性程度大小的值。它于1982年被Jack Kyte與 Russell Doolittle首先提出［20］。親水指數越大，這種氨基酸的疏水性就越強。在18～22處有一顯著親水區域，200～205及265～271有兩段顯著疏水區域。此外，疏水性氨基酸在25～75及113～160兩端區域分布較為集中，而在205～260這一區域親水性氨基酸分布較為集中，其余區域親疏性氨基酸大致呈均勻分布。接著，我們使用TMpred程序預測HSK跨膜結構域，結果(圖5)顯示，在145～163(o→i)、145 ～168(i→o)、255 ～277(o?i)、304 ～325(i→o)、307～325(o→i)等5個區域可能存在不同朝向的跨膜結構域。而跨膜結構域(Transmembrane domain)通常是指跨膜蛋白上的一個跨膜α-螺旋(極少數為β-桶裝結構)，但從更廣義的角度來說，跨膜結構域是指在膜上具有熱力學穩定性的任意蛋白質三維結構［21］。聯系疏水性與跨膜結構域的預測結果來看，在145～168、255～277和304～325三個存在跨膜結構預測峰的片段中，絕大多數都為疏水性氨基酸，符合跨膜結構對片段長度和疏水性的基本要求。而其中尤為值得注意的是255～277這一段序列，這一包含了23個具有極強疏水性的片段很可能為跨膜α-螺旋，而這一猜測在利用NPS程序對二級結構進行預測的結果(圖3)中也似乎得到了驗證。此外，我們利用ScanProsite工具對HSK的翻譯后修飾位點進行預測分析后發現，在257～260處可能存在1個天冬酰胺糖基化位點(-NSSQ-)。多重預測結果集中出現在255～277這一區域，是否預示著HSK除了催化高絲氨酸磷酸化之外，這一區域的存在是否會賦予HSK其它未知功能，還有待進一步研究。

與二級結構預測相比，蛋白質三級結構預測的成功率要低得多。這可能是因為高級結構折疊關鍵決定于序列中的間隔距離的殘基之間的特異側鏈相互作用。目前，預測蛋白質三級結構的方法主要有三種，同源建模法、串線法(折疊識別法)和從頭預測法，而其中同源建模法的應用范圍最廣，構建成功率相對較高。此法主要步驟有:結構保守性分析，主側鏈結構預測以及模型優化［22］。我們以1FWL.A為模板，利用SWISS-MODEL進行同源建模，再經Chimera(V 1.8.1)做優化處理，最后利用 Molprobity4 及ERRAT(V 2.0)對模型進行立體化學質量評估。Molprobity4評估結果顯示，HSK三級結構模型中，有91.00%的殘基位于一般允許區以內，98.71%的位于最大允許區以內，clashscore=1.3，molProbity score=1.93;而 133-VAL(-154.50，76.17)、351-VAL(66.65，93.36)和 360-VAL(76.71，14.05)這三個殘基介于一般允許區和最大允許區之間，它們的空間位置或折疊構象可能不盡合理，但90-SER(-61.99，21.16)位于最大允許區外，表明其空間位置錯誤，仍需進一步的修飾。但就整體而言，該模型具有穩定的空間構型。ERRAT(V 2.0)對模型的進一步驗證表明，該模型(92.905)的空間構型基本正確，整體構象符合立體化學規則。

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