Varp蛋白影響人宮頸癌Hela細胞增殖及凋亡的研究＊

王 芳，張 嵐

(廣州醫科大學，醫學遺傳學及細胞生物學教研室，廣東 廣州 510182)

Varp蛋白是近年來發現的一種新蛋白，可作為小分子GTP結合蛋白超家族中最大的一個亞家族--Rab蛋白家族成員Rab21的鳥苷酸轉換因子(guanine nucleotide exchange factor，GEF)及 Rab38 的效應蛋白(effector)調節細胞內吞及膜轉運［1，2］。最新研究表明，Varp在黑色素細胞中可以通過與Rab38/Rab32的相互作用調節Tyrp1在細胞中的轉運［3］，還能夠通過調節Rab21在黑色素細胞或神經細胞突起的形成過程中發揮作用［4，5］。目前除了上述研究以外，對這一新蛋白其他功能的了解還非常缺乏。

Varp在許多腫瘤細胞株中都有表達，但在人宮頸癌 Hela細胞中的表達水平相對更低［1］。因此，Varp是否在宮頸癌的發生發展中發揮作用，值得深入研究。

1 材料與方法

1.1 質粒

空載體pEFNeo、攜帶新霉素抗性基因及c-Myc標簽的Varp真核蛋白表達載體質粒pEFNeo/Varp-Myc為本實驗室保存。

1.2 主要試劑

DMEM細胞培養基購自Hyclone公司。Lipofectamine 2000轉染試劑為Invitrogen公司產品。新霉素G418(Neomycin)購自 Gibco公司。3H-TdR購自北京原子能研究所。碘化丙啶(PI)購自Sigma公司。BCA蛋白定量試劑盒購自Thermo Scientific Pierce公司。小鼠抗c-Myc單克隆抗體為Santa Cruz公司產品，用于細胞免疫熒光的熒光標記羊抗小鼠IgG購自Jackson ImmunoResearch Laboratories。

1.3 細胞培養及細胞系構建

Hela細胞培養于10%胎牛血清的DMEM細胞培養液中，放置于37℃，5%二氧化碳濃度的細胞培養箱中進行培養。按Invitrogen公司說明書方法使用Lipofectamine 2000轉染試劑分別向Hela細胞轉染pEFNeo/Varp-Myc質粒及空載pEFNeo(作為對照)。轉染24 h后，收集細胞并重新分入96孔板中，使每孔約含有10個細胞。細胞貼壁后，加入G418，濃度為1 mg/mL。37℃培養細胞，每4 d換新鮮培養基，G418濃度不變。至有單克隆產生，選取單克隆培養，能夠穩定表達 Varp蛋白的細胞系 Hela通過Western Blotting及細胞免疫熒光鑒定。

1.4 Western Blotting

收集培養細胞，提取細胞總蛋白，BCA試劑盒定量。以50 μg/孔的上樣量進行5%濃縮膠及12%分離膠的SDS-PAGE后電轉移至PVDF膜;轉膜后，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，c-Myc抗體(1∶1000稀釋)雜交，滴加ECL發光試劑，在暗室中壓片，顯影，定影。

1.5 細胞免疫熒光

待檢測細胞培養至密度50%左右，PBS洗滌，固定液(含4%的多聚甲醛的PBS)室溫固定20 min。PBS洗滌后加入穿透液(含0.2%Triton X-100的PBS)，室溫10 min。PBS洗滌后用封閉液(含10%牛血清的PBS)室溫封閉1 h。一抗室溫孵育1 h(抗c-Myc抗體1∶100稀釋于含2%血清的PBS)或4℃過夜。除去一抗，洗滌液(含0.05%Tween-20，1%BSA的PBS)洗滌。二抗(稀釋度為1∶200)避光孵育，室溫1 h。除去二抗，洗滌液洗滌。DAPI復染細胞核，洗滌液洗滌。使用防熒光淬滅封片劑封片。激光共聚焦顯微鏡觀察并采集圖像。

1.6 3H-TdR摻入法測定細胞增殖曲線

取對數生長期的Hela/Mock及Hela/Varp細胞分別接種于24孔板中，每孔5 x 103個。每種細胞每天取3孔平行對照測定。分別于接種后48 h、72 h、96 h、120 h 更換含 3H-TdR(1 μCi/孔)的全培養基(更換培養基之前細胞需血清饑餓24 h)，繼續培養5 h后，吸棄培養液，PBS洗滌細胞3次。每孔加入細胞裂解液125 μL，待細胞裂解后，吸取 100 μL至濾膜，37℃干燥后將濾膜放入閃爍瓶中加閃爍液，避光放置2 h后，用Beckman液體閃爍計數儀測定每分鐘脈沖數(counts/min，CPM)。

1.7 流式細胞術檢測細胞凋亡

將Hela/Mock及Hela/Varp培養24 h后胰酶消化收集細胞，PBS緩沖液洗滌1遍，加入-20℃預冷75%乙醇固定，4℃過夜。檢測前預冷PBS緩沖液洗滌2遍，以含有RNaseA(終濃度20 μg/mL)的PBS緩沖液重懸細胞，37℃處理30 min。碘化丙啶(PI)(終濃度50 μg/mL)進行染色，避光反應15 min后流式細胞儀(BD，美國)檢測細胞凋亡水平。本實驗重復三次。

1.8 統計學方法

應用SPSS13.0統計軟件進行數據分析，計量資料的比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Varp穩定表達的Hela細胞系的鑒定

用新霉素G418對轉染pEFNeo/Varp-Myc質粒后的Hela細胞進行篩選，得到具有新霉素抗性的單克隆細胞。為了排除假陽性細胞(僅有新霉素抗性基因表達而無Varp表達)，采取Western Blotting及細胞免疫熒光對穩定表達Varp蛋白的單克隆細胞進行鑒定。

2.1.1 Western Blotting結果 由于Varp真核蛋白表達載體攜帶c-Myc標簽，因此在細胞中能夠表達c-Myc-Varp融合蛋白。以小鼠抗c-Myc單克隆抗體為一抗進行Western Blotting檢測，結果顯示，在7#細胞克隆中有明顯的c-Myc-Varp融合蛋白表達(圖1)。后續實驗以此細胞克隆作為Varp穩定表達的細胞系Hela/Varp，以空載細胞Hela/Mock作為對照。

2.1.2 細胞免疫熒光結果 以小鼠抗c-Myc單克隆抗體為一抗對Hela/Mock及Hela/Varp進行細胞免疫熒光檢測，結果如圖2所示，Varp在Hela/Varp細胞中表達，且在核區更為集中。Hela/Mock中未檢測到熒光信號(數據未顯示)。

圖1 Hela/Varp細胞系中的Varp表達Fig.1 Expression of Varp in Hela/Varp stable cell line

圖2 Hela/Varp細胞免疫熒光(藍色示細胞核，綠色熒光示Varp表達)Fig.2 Cell Immunofluorescence in Hela/Varp(Blue:Nucleus Green:Expression of Varp)

2.2 Varp蛋白抑制Hela細胞增殖

為了檢測Varp蛋白對Hela細胞增殖的影響，采取3H-TdR摻入法測定各細胞增殖曲線。結果顯示，Hela/Varp的增殖明顯低于Hela/Mock(圖3)。

圖3 Hela/Mock與Hela/Varp細胞增殖曲線Fig.3 Cell proliferation of Hela/Mock and Hela/Varp

2.3 Varp蛋白增加Hela細胞凋亡

為了檢測Varp蛋白對Hela細胞凋亡的影響，采取PI染色流式細胞術檢測各細胞的凋亡情況。結果顯示，Hela/Varp的凋亡率明顯高于Hela/Mock(圖4)。

圖4 Hela/Mock與Hela/Varp細胞凋亡情況Fig.4 Apoptosis of Hela/Mock and Hela/Varp

3 討論

Varp是近年來發現的一個新蛋白，其功能很不明確。宮頸癌是女性生殖系統常見的惡性腫瘤，由人乳頭瘤病毒(HPV)引起［6］。本研究初步證明Hela細胞中穩定表達Varp后，細胞增殖能力降低，細胞凋亡率增加。由于Varp能夠調節細胞內吞及膜轉運，且已有研究表明過量表達的Varp能夠降低腺病毒感染細胞的效率［7］，因此后續研究將進一步檢測其是否能夠在HPV病毒感染細胞的過程中發揮作用。另外，宮頸癌的發生發展還與很多細胞信號通路相關，例如 MAPK、Notch1、TGF-Smads、Wnt等等信號通路［8-11］。Varp是否在信號分子的細胞內吞、胞內膜轉運等環節起到作用，通過調節細胞信號通路影響腫瘤細胞的生長，也是后續研究中需進一步求證的。

宮頸癌的傳統治療手段以手術、放療、化療為主。近年來，包括基因治療在內的生物治療手段，能夠高度選擇性地促進腫瘤細胞凋亡而不損傷正常細胞，為宮頸癌的治療提供了全新的模式。宮頸癌的基因治療主要是通過誘導促凋亡分子或者抑制抗凋亡分子來促進腫瘤細胞的凋亡。宮頸癌相關的促凋亡分子包括caspase家族成員、TNF相關凋亡誘導配體(TNF relatedapoptosis inducing ligand，TRAIL)、Fas/FasL等;抗凋亡分子則包括Bcl-2、FLIP(fas-associated protein with death domain-like IL-1β-converting enzyme inhibitory protein)、X-連鎖的抑制凋亡蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)等［12］。因此，后續研究中還將檢測Varp是否影響了上述宮頸癌相關促凋亡分子及抗凋亡分子的表達，從而進一步明確Varp影響Hela細胞凋亡的機理。

［1］ZHANG X，HE X，FU X Y，et al.Varp is a Rab21 guanine nucleotide exchange factor and regulates endosome dynamics［J］.J Cell Sci，2006，119(6):1053-1062.

［2］WANG F，ZHANG H，ZHANG X，et al.Varp interacts with Rab38 and functions as its potential effector［J］.Biochem Biophys Res Commun，2008，372(1):162-167.

［3］TAMURA K，OHBAYASHI N，MARUTA Y，et al.Varp is a novel Rab32/38-binding protein that regulates Tyrp1 trafficking in melanocytes ［J］. MolBiolCell，2009，20(12):2900-2908.

［4］BURGO A，SOTIRAKIS E，SIMMLER M C，et al.Role of Varp，a Rab21 exchange factor and TI-VAMP/VAMP7 partner，in neuritegrowth ［J］. EMBORep，2009，10(10):1117-1124.

［5］OHBAYASHI N，YATSU A，TAMURA K，FUKUDA M，et al.The Rab21-GEF activity of Varp，but not its Rab32/38 effector function，is required for dendrite formation in melanocytes［J］.Mol Biol Cell，2012，23(4):669-678.

［6］CASTELLSAGUè X.Natural history and epidemiology of HPV infection and cervical cancer［J］.Gynecol Oncol，2008，110(3Suppl 2):S4-7.

［7］王芳，蘇曉波，張嵐.Varp過表達降低腺病毒感染細胞效率的研究［J］.激光生物學報，2013，22(5):436-440 WANG Fang，SU Xiaobo，ZHANG Lan，Study of Varp overexpression reduces adenovirus infection efficiency［J］.Acta Laser Biology Sinica，2013，22(5):436-440

［8］MEIRA D D，DE ALMEIDA V H，MORORó J S，et al.Combination of cetuximab with chemoradiation，trastuzumab or MAPK inhibitors:mechanisms of sensitisation ofcervical cancer cells［J］.Br J Cancer，2009，101(5):782-791.

［9］MALIEKAL T T，BAJAJ J，GIRI V，et al.The role of Notch signaling in human cervical cancer:implications for solid tumors［J］.Oncogene，2008，27(38):5110-5114.

［10］LICHTIG H，GILBOA D A，JACKMAN A，et al.HPV16 E6 augments Wnt signaling in an E6AP-dependent manner［J］.Virology，2010，396(1):47-58.

［11］IANCU I V，BOTEZATU A，GOIA-RU?ANU C D，et al.TGF-beta signalling pathway factors in HPV-induced cervical lesions［J］.Roum Arch Microbiol Immunol，2010，69(3):113-118.

［12］LAGUNAS-MARTíNEZ A，MADRID-MARINA V，GARIGLIO P.Modulation of apoptosis by early human papillomavirus proteins in cervical cancer［J］.Biochim Biophys Acta，2010，1805(1):6-16.