虎紋蛙消化道淀粉酶和脂肪酶活力研究＊

李 慶，張 雪，余昌萍，汪 娟，余晶晶，張盛周

(安徽師范大學生命科學學院生物環境與生態安全省級重點實驗室，安徽 蕪湖 241000)

虎紋蛙(Rana rugulosa)隸屬兩棲綱(Amphibia)、無尾目(Anura)、蛙科(Ranidae)，在我國分布較廣，長江以南各省均有較多分布，俗名田雞、水雞等，體型大、肉味鮮美，歷來是人們喜愛的美味佳肴，在市場上很受歡迎，具有重要的經濟價值和生態價值［1］。近年來，由于過度捕殺和生態環境的惡化，虎紋蛙數量正急劇減少，有的地區漸危甚至瀕危，已列為國家二級重點保護野生動物。為保護野生動物資源，同時滿足人們的生活需求，近年來虎紋蛙的人工養殖已越來越受到重視［2，3］。

消化酶的活力是反映動物消化機能的一項重要指標，研究消化酶的活力及其影響因素可了解動物對食物不同成分的消化能力，進而為確定動物飼料成分與配料比，優化養殖條件，提高養殖效率提供理論指導。目前，對低等脊椎動物消化酶的研究主要集中在經濟養殖型魚類［4-11］和爬行類［12-14］，近年來對兩棲類消化酶的研究報道也逐漸增多［15-21］。本實驗室曾對虎紋蛙消化道蛋白酶活力進行過研究［21］，虎紋蛙屬肉食性，實驗中我們發現虎紋蛙消化道亦有較高的淀粉酶和脂肪酶活力，本文特對此進行報道，為虎紋蛙的人工養殖提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

鮮活的虎紋蛙成體購自蕪湖市鏡湖區黃山西路菜市場，重150 g～200 g。將虎紋蛙雙毀髓處死，解剖，迅速取出完整消化道，去除其表面雜物，用4℃預冷的0.65%的生理鹽水快速洗凈，按食道、胃、前腸、中腸和后腸取材，用吸水紙輕輕吸干，稱重。

1.2 酶液的制備

依據所稱組織的質量克數，食道、胃加入5倍質量的4℃預冷蒸餾水;其它部位加入10倍質量的4℃預冷蒸餾水，在冰水浴中充分勻漿，搗成糜狀，以4000 r/min冷凍離心10 min，取上清液即為粗酶液。保存于4℃冰箱中，8 h內分析完畢;或 －20℃下保存，72 h內分析完畢。

1.3 淀粉酶和脂肪酶活力的測定

1.3.1 淀粉酶和脂肪酶在消化道中的活力分布消化道剪開后，立即用精密pH試紙測得各部位消化液的pH值作為其生理pH值。實驗測得虎紋蛙食道、胃、前腸、中腸和后腸的生理pH值依次為:6.0－ 7.5、2.0－6.5、7.0 －8.5、7.5－8.5 和 7.0－8.5。參照各部位的生理pH值，分別在pH值為5.0、5.0、8.0、8.0 和 8.0，溫度為 30 ℃ 條件下，測定食道、胃、前腸、中腸和后腸的淀粉酶和脂肪酶活力。

1.3.2 淀粉酶活力的測定 采用3，5-二硝基水楊酸比色法［20］，略有改動。實驗組取0.665 mL待測粗酶液于各試管，再分別加入相應pH值的緩沖液0.665 mL，混勻，將實驗組置于30℃恒溫水浴鍋中預熱5 min～10 min;對照組用相應量的蒸餾水取代粗酶液，其余條件一致。再向實驗組和對照組試管中加入已預熱的2%的淀粉溶液0.670 mL，搖勻，于30℃水浴反應40 min后再加入2 mL的3，5-二硝基水楊酸，搖勻。立即放入100℃沸水中顯色5 min，使酶失活并終止反應，流水冷卻后稀釋10倍，7200型分光光度計，490 nm波長條件下比色，測吸光值。以30℃下每分鐘水解淀粉產生1 mg麥芽糖作為一個酶活力單位。

1.3.3 脂肪酶活力的測定 采用對硝基苯基丁酸(PNPB)法測脂肪酶活力［22］，略有改動。實驗組取相應pH值的緩沖液970 μL于2 mL比色皿中，再加入20 μL待測粗酶液;對照組加入990 μL相應pH值的緩沖液。再向實驗組和對照組中加入溶解在乙腈中的50 mmol/L PNPB溶液10 μL，搖勻。立即放入30℃水浴反應5 min后，用7200型分光光度計，410 nm波長條件下比色，測光吸收值。以30℃下每分鐘水解底物生成1 μmol對硝基苯酚(PNP)所需的酶量作為一個酶活力單位。

1.4 pH梯度的設置

利用不同pH值的緩沖液來配置實驗中所需的各種 pH條件。實驗中共使用4種緩沖液，pH1.5～2.2的緩沖液用 KCl-HCl配制;pH3.0 ～8.0 的緩沖液用Na2HPO4-檸檬酸配制;pH8.0～9.6的緩沖液用巴比妥鈉-鹽酸配制;pH10.0的緩沖液用甘氨酸-NaOH配制。胃消化酶活力測定所需的pH值范圍為1.5、2.2、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、8.6、9.0 和9.6，共11個pH值梯度。腸消化酶活力測定所需的的 pH 值范圍為 4.0、5.0、6.0、7.0、7.4、8.0、9.0、9.6和10.0，共9個 pH 值梯度。利用上述方法，在30℃條件下測定胃和腸淀粉酶和脂肪酶的最適pH值。

1.5 溫度梯度的設置

采用恒溫水浴鍋控制水溫，設置15℃、20℃、25 ℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃共11個溫度梯度，利用實驗所得的最適pH值，選擇相應的緩沖液按上述方法分別測定胃和腸淀粉酶和脂肪酶在不同溫度條件下的活力。

1.6 數據處理

2 結果

2.1 虎紋蛙消化道淀粉酶和脂肪酶的分布

2.1.1 淀粉酶在消化道中的活力分布 在各部位生理pH條件下，溫度為30℃時虎紋蛙消化道各部位淀粉酶的活力分布見圖1。由圖1可知，不同部位淀粉酶的活力由大到小依次是前腸＞中腸＞后腸＞食道＞胃，腸道各段淀粉酶活力顯著高于食道和胃(P＜0.05)，其中前腸的淀粉酶活力是食道的3.9倍，是胃的4.6倍。食道淀粉酶活力略微高于胃，但差異不顯著(P＞0.05)。前腸淀粉酶活力顯著大于后腸(P＜0.05)，但與中腸之間無顯著性差異(P＞0.05)。中腸的淀粉酶活力顯著高于后腸(P＜0.05)。

圖1 虎紋蛙消化道淀粉酶的活力分布Fig.1 The distribution of amylase in the digestive tract of Rana rugulosa

2.1.2 脂肪酶在消化道中的活力分布 虎紋蛙消化道各部位脂肪酶的活力分布見圖2。由圖2可知，不同部位脂肪酶的活力由大到小依次是中腸＞后腸＞前腸＞胃＞食道，腸道各段脂肪酶活力顯著高于食道和胃(P＜0.05)，其中中腸脂肪酶活力是食道的109.9倍，是胃的65.8倍。胃脂肪酶活力顯著高于食道(P＜0.05)。前腸、中腸和后腸之間的脂肪酶活力差異顯著(P＜0.05)。

2.2 pH對淀粉酶和脂肪酶活力的影響

圖2 虎紋蛙消化道脂肪酶的活力分布Fig.2 The distribution of lipase in the digestive tract of Rana rugulosa

2.2.1 pH對淀粉酶活力的影響 不同pH條件下，虎紋蛙胃和腸道淀粉酶的活力變化見圖3。由圖3可知，胃和腸道淀粉酶的最適pH值分別為8.6和7.0。胃淀粉酶活力與pH的關系曲線呈單峰型，pH對胃淀粉酶活力影響較大，pH值在1.5～7.0之間，淀粉酶的活力逐漸緩慢上升，在pH值大于7.0以后，淀粉酶活力顯著上升(P＜0.05)，到8.6時達到最大值，之后顯著下降(P＜0.05)。腸道淀粉酶活力與pH的關系曲線亦呈單峰型，pH值小于7.0時，酶活力逐漸上升，pH值為7.0時，達到最大值，之后先緩慢下降(P ＞0.05)，后急劇下降(P ＜0.05)。

圖3 pH對淀粉酶活力的影響Fig.3 Effects of pH on the activities of amylase

2.2.2 pH對脂肪酶活力的影響 不同pH條件下，虎紋蛙胃和腸道脂肪酶的活力變化見圖4。由圖4可知，胃和腸道脂肪酶的最適pH值均為9.0。胃和腸道脂肪酶活力與pH的關系曲線均為雙峰型，pH值對脂肪酶活力影響較大。當pH值為4.0時，胃脂肪酶活力有一個較小的峰值，接著在pH值為9.0時又出現一個較大的峰值，此時的酶活力約為pH值為4.0時的10.1倍。當pH值為5.0時，腸道脂肪酶活力有一個較小的峰值，接著在pH值為9.0時又出現一個較大的峰值，此時的酶活力約為pH值為5.0時的9.0 倍。

圖4 pH對脂肪酶活力的影響Fig.4 Effects of pH on the activities of lipase

2.3 溫度對淀粉酶和脂肪酶活力的影響

2.3.1 溫度對淀粉酶活力的影響 不同溫度條件下，虎紋蛙胃和腸道淀粉酶的活力變化見圖5。由圖5可知，胃和腸道淀粉酶活力與溫度的關系曲線均為單峰型，最適溫度分別為35℃和40℃。溫度范圍在15～35℃時，胃淀粉酶活力逐漸上升，溫度為35℃時達到最大值，之后顯著下降(P＜0.05)，溫度為50℃時的酶活力僅為最大酶活力的30%左右。腸道淀粉酶活力隨溫度上升變化較大，溫度從15℃上升為40℃時，腸道淀粉酶活力約上升了3倍，溫度為40℃時達到最大值，之后緩慢下降。

圖5 溫度對淀粉酶活力的影響Fig.5 Effects of temperature on the activities of amylase

2.3.2 溫度對脂肪酶活力的影響 不同溫度條件下，虎紋蛙胃和腸道脂肪酶的活力變化見圖6。由圖6可知，胃和腸道脂肪酶活力與溫度的關系曲線均為單峰型，最適溫度分別為50℃和55℃。胃脂肪酶活力在溫度范圍15～50℃內逐漸上升，在50℃時達到最大值，之后顯著下降(P＜0.05)，溫度為65℃時的酶活力只有最大酶活力的11%左右。腸道脂肪酶活力在溫度小于55℃時，脂肪酶活力逐漸上升，當溫度為55℃時，酶活力達到最大值，之后顯著下降(P ＜0.05)。

圖6 溫度對脂肪酶活力的影響Fig.6 Effects of temperature on the activities of lipase

3 討論

3.1 虎紋蛙消化酶的分布

動物的食性往往與其消化酶組成密切相關。蛙類多屬肉食性動物，主要以消化蛋白質和脂肪為主，但本研究顯示虎紋蛙消化道具淀粉酶活力，這提示在配制虎紋蛙飼料時可適當添加淀粉成分。不同消化酶在虎紋蛙消化道中的活力分布差異較大。淀粉酶活力主要分布在腸道，以前腸較高，中腸和后腸依次次之，這與牛蛙［20］和黑斑蛙［15］淀粉酶活力主要分布在中腸有所不同，但與某些魚類如大菱鲆［5］、洞庭鲇魚［9］等相似。脂肪酶活力亦主要分布于腸道，特別是中腸，這與牛蛙［20］有所不同，但與黑斑蛙［16］和棘腹蛙［17］，有胃魚類中的中華鱘［10］和黑鯛［11］，爬行類動物中的中華鱉［13］等相一致。虎紋蛙胃中具有較高的蛋白酶活力［21］，顯示蛋白質的消化主要集中在胃中;本實驗測得其淀粉酶和脂肪酶主要分布于腸道，顯示淀粉和脂肪的消化主要在腸道中進行。蛙類通常將食物不加咀嚼就吞入胃中，根據虎紋蛙的這種消化特點和攝食習性，在配制飼料時，可以通過制作以蛋白質為主的外層包裹適當的淀粉和脂肪成分的復合飼料，以提高虎紋蛙的消化效率，以及飼料的利用率，降低養殖成本。

3.2 pH對消化酶活力的影響

大多數酶的活力受pH的影響極為顯著，通常只有在一定的 pH范圍內才能表現出其活力，在一定pH值下，酶促反應速度有最大值。本實驗結果顯示，虎紋蛙胃和腸道淀粉酶的最適pH值分別為8.6和7.0，其中腸道淀粉酶的最適pH值在腸內的生理pH范圍內，而胃淀粉酶的最適pH值遠超出胃內實測的 pH 范圍(2.0 －6.5)，這與牛蛙［20］和黑斑蛙［15］的胃淀粉酶類似，可見，蛙類胃內的 pH環境均不適合淀粉酶活力的發揮。虎紋蛙胃和腸道淀粉酶的最適 pH 值均在中性偏堿性的范圍內，比魚類［4，8，9，20］稍高，但與兩棲類中的牛蛙［20］和黑斑蛙［15］，爬行類中的中華鱉［14］基本一致。虎紋蛙胃和腸道脂肪酶活力受 pH影響較大，均呈明顯的雙峰型，最適pH值均9.0。胃脂肪酶最適 pH 值與牛蛙的 2.2［20］、黑斑蛙的 5.0［16］以及棘腹蛙的 5.0［17］，有較大的差異，顯示明顯的物種特異性。虎紋蛙腸道脂肪酶最適pH值為 9.0，接近其生理pH，與黑眶蟾蜍等蛙類［15，17，18，20］、魚類［5，9，11］以及中華鱉［13］等相似。

虎紋蛙胃蛋白酶的最適pH值為1.5，略低于胃內的生理pH［21］。動物胃內pH值變化較大，主要由于食物刺激胃壁分泌胃液、胃酸等物質引起。蛙類主要以吞食的方式進食，將食物不經咀嚼便整個吞下，塊狀的食物增加了對胃壁的刺激，促進了胃酸的分泌，降低胃內pH值，這時有利于蛋白酶活力的發揮而對淀粉酶和脂肪酶活力的發揮不利;但當經過胃初步消化后的食物進入腸道后，食物中的淀粉和脂肪成分可在腸道中消化，這進一步表明制作多層復合飼料有利于提高其消化效率。

3.3 溫度對消化酶活力的影響

虎紋蛙屬變溫動物，其消化道內的溫度一般隨著棲息環境溫度的改變而改變。本實驗測得虎紋蛙胃和腸道淀粉酶最適溫度分別為35℃和40℃，脂肪酶最適溫度分別為50℃和55℃，我們之前的研究顯示虎紋蛙胃和腸道蛋白酶的最適溫度均為50℃［21］。虎紋蛙蛋白酶和脂肪酶最適溫度要遠遠高于其棲息的環境溫度，也遠遠高于其生理極限溫度，這一現象與黑眶蟾蜍等兩棲類類似［15，17，18，20］，在魚類亦普遍存在［8］。淀粉酶的最適溫度接近最適生長溫度，與其他兩棲類動物基本一致。消化酶的化學本質是蛋白質，其活性易受溫度的影響，這就決定了酶促反應對溫度具有高度敏感性。溫度升高，一方面，增加酶活力使酶促反應速率加快;另一方面，加速酶的失活使酶促反應速率降低。溫度對酶促反應的雙重作用，決定了酶的最適溫度隨反應時間延長而下降。離體條件下測定的消化酶最適溫度可反映消化酶的熱穩定性和溫度對酶活力的影響規律。虎紋蛙消化道淀粉酶的熱穩定性明顯比脂肪酶和蛋白酶差。根據這一特性，在虎紋蛙人工養殖的過程中，當環境溫度升高時，可考慮適當減少飼料中淀粉成分的配比，增加脂肪和蛋白質成分。

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