黃芪甲苷、人參皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷R1抗小鼠腦缺血再灌注氧化應激損傷和促進能量代謝的配伍研究

黃小平，王 蓓，邱詠園，曾 嶸，鄧常清，唐映紅*

（湖南中醫藥大學分子病理實驗室，湖南省中西醫結合心腦血管疾病重點實驗室，細胞生物學與分子技術湖南省高校重點實驗室，湖南 長沙 410208）

黃芪甲苷、人參皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷R1抗小鼠腦缺血再灌注氧化應激損傷和促進能量代謝的配伍研究

黃小平，王 蓓，邱詠園，曾 嶸，鄧常清，唐映紅*

（湖南中醫藥大學分子病理實驗室，湖南省中西醫結合心腦血管疾病重點實驗室，細胞生物學與分子技術湖南省高校重點實驗室，湖南 長沙 410208）

目的 從氧化應激和能量代謝研究黃芪甲苷、人參皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷R1抗小鼠腦缺血再灌注損傷的配伍關系，明確其有效的配伍劑量。方法 采用L9（34）正交試驗法，將C57BL/6小鼠隨機分組，連續給藥3 d后結扎雙側頸總動脈造成腦缺血20 min，再灌注30 min，測定腦組織三磷酸腺苷（ATP）、還原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH）含量、丙二醛（Malonaldehyde，MDA）的含量及超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）的活性。結果 黃芪甲苷、人參皂苷Rb1、Rg1和三七皂苷R1能增加腦組織中ATP、GSH含量和SOD活性，降低MDA的含量，對腦缺血再灌注后的氧化應激損傷具有抑制作用，改善腦組織能量代謝。4種有效成分配伍具有增強抗腦缺血再灌注損傷的作用。結論 4種有效成分抗小鼠腦缺血再灌注后氧化應激損傷和改善能量代謝的有效配伍劑量為黃芪甲苷40 mg/kg，人參皂苷Rg150 mg/kg，人參皂苷Rb140 mg/kg，三七皂苷R110 mg/kg。

黃芪甲苷；人參皂苷Rg1；人參皂苷Rb1；三七皂苷R1；配伍；腦缺血再灌注；氧化應激；能量代謝

缺血性腦損傷的病理過程極為復雜，其發病機制與腦組織能量代謝障礙、興奮毒性、氧化應激、炎癥反應等有關[1]。中醫藥理論認為，缺血性腦損傷的基本病理機制多為氣虛血滯、脈絡瘀阻，因此，常采用益氣活血法治療[2]。研究表明，黃芪和三七具有抗腦缺血的作用，二者配伍可增強其抗缺血性腦損傷的作用。黃芪中的主要有效成分是黃芪總皂苷（Astragalosides，AST），主要含黃芪甲苷等活性成分；三七中的主要有效成分是三七總皂苷（Panax notoginseng saponins，PNS），主要含人參皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷R1等活性成分。我們以往的研究表明，AST和PNS配伍具有增強其抗腦缺血的作用[3-5]。因此，我們認為，中藥有效組分配伍協同增效的作用是其有效成分合理配伍作用的結果[6]，AST和PNS配伍增強抗腦缺血作用是其有效成分配伍所致。為進一步明確黃芪和三七配伍增強抗腦缺血作用的機制，本研究對其主要的有效成分進行了配伍關系的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級C57BL/6雄性小鼠，體質量為22～28 g，由湖南中醫藥大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（湘）2009-0004。飼養于室溫25℃，濕度55%的環境。

1.1.2 藥物 黃芪甲苷 （批號：MUST-09102301）、人參皂苷Rg1（批號：MUST-11041201）、人參皂苷Rb1（批號：MUST-11042801）、三七皂苷R1（批號MUST-11041201），純度均≥98%，均由成都曼思特生物科技有限公司提供，用時溶于5%羧甲基纖維素鈉溶液中。

1.1.3 試劑與儀器 脂質過氧化物丙二醛（MDA）含量測定試劑盒（批號：20120222）、谷胱甘肽（GSH）含量測定試劑盒（批號：20120220）、超氧化物歧化酶（SOD）活性測定試劑盒（批號：20120218）、考馬斯亮藍化學比色法總蛋白含量測定試劑盒 （批號：20111212），均購于南京建成生物工程研究所。ATP標準品為Sigma公司產品，其他試劑為國產分析純。液相色譜儀（Agilent 1200 series），液相色譜柱（Hypersil，ODS2，5μm，250 mm×4.6 mm）。

1.2 方法

1.2.1 分組和給藥方法 前期實驗表明[3]，PNS和AST抗腦缺血的有效配伍劑量為AST 110 mg/kg+ PNS 115 mg/kg。換算成各有效成分的劑量為：黃芪甲苷41.8 mg/kg，人參皂苷Rg158 mg/kg，人參皂苷Rb135.5 mg/kg，三七皂苷R114.4 mg/kg。以本劑量為依據，分別設立高、中、低劑量水平，采用L9（34）正交試驗，共組成9個配伍組合（見表1）。另設假手術對照組（即試驗組0，予0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液），共10組，按0.1 mL/10 g灌胃給藥，每日1次，連續給藥3 d，于末次給藥1 h后造模，術前禁食12 h。按文獻方法制備腦缺血再灌注模型[7]。將小鼠以無水乙醚吸入麻醉后仰臥位固定，在頸部正中做1 cm垂直切口，分離頸總動脈及伴行的迷走神經，夾閉雙側頸總動脈，造成腦缺血，20 min后恢復血流，再灌注30 min后斷頭取腦，去除小腦和腦干，做相應指標檢測。假手術組也進行同樣手術，但不行腦缺血再灌注，其他操作與以上各組相同。

表1 L9(34)篩選4種有效成分配伍給藥劑量表（mg/kg，n=4）

1.2.2 氧化應激指標的測定 取左腦皮質約120 mg，按質量/體積1∶9以0.01 mol、pH 7.4的磷酸鹽緩沖液制成10%組織勻漿液，4℃離心5 min（2 500 r/min），取上清液按試劑盒說明測定MDA、 GSH、SOD。

1.2.3 腦組織 ATP的測定 取右腦皮質約120 mg，按質量/體積1∶9以5%的冷高氯酸制成10%組織勻漿液，4℃離心15 min（15 000 r/min），取上清液約0.8 mL，加入 3 mol/L的 K2CO3約0.12 mL，調pH至中性，4℃離心5 min（3 000 r/min），取上清液以高效液相色譜（HPLC）測定ATP含量。HPLC測定條件：ODS-18液相色譜柱；流動相為 K2HPO4（A）-KH2PO4（B），梯度洗脫：0～12 min，86.8%B，12～22 min，85.5%B，22～38 min，86.8%B；柱溫25℃；檢測波長：254 nm；流速：0.7 mL/min；進樣量：10 μL。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 各組氧化應激指標和ATP的比較

與假手術組比較，模型組腦組織ATP、GSH含量顯著降低，MDA含量顯著增加，而SOD活性降低（均P<0.01）；與模型組比較，各配伍組均能不同程度地升高ATP、GSH含量（P<0.05或P<0.01），降低MDA含量（P<0.01），使SOD活性升高（P<0.05或P< 0.01）。見表2。

表2 各組氧化應激指標和ATP的比較 （±s，n=4）

表2 各組氧化應激指標和ATP的比較 （±s，n=4）

注：vs.假手術組（試驗組0）△P<0.05，△△P<0.01；vs.模型組（試驗組1）★P<0.05，★★P<0.01。

試驗組別0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 ATP（μg/g組織）503.60±48.57 285.16±44.79△△428.23±26.95★★394.28±21.82★★398.95±12.77★★249.69±7.86 504.84±34.47★★679.77±22.01★★329.05±8.38★464.87±28.13★★SOD（U/mg蛋白）65.41±1.71 38.97±1.68△△45.26±1.27★★44.51±3.13★★45.07±3.71★★58.02±2.43★★40.73±3.12 46.22±2.27★★59.78±2.03★★43.69±2.50★MDA (nmol/mg蛋白) 75.64±2.77 115.63±3.28△△97.74±2.20★★74.64±2.76★★78.38±1.25★★79.88±2.38★★62.54±1.72★★108.58±5.88★★119.32±2.22 105.70±1.50★★GSH（mg/g蛋白）3.40±0.40 1.17±0.37△△1.70±0.25★2.38±0.52★★2.32±0.28★★3.23±0.43★★1.39±0.30 2.31±0.23★★2.07±0.32★★3.24±0.40★★

2.2 各指標的正交試驗分析

ATP應當以含量高為好，故在本實驗條件下，配伍劑量應以 A3B3C3D2為最佳方案，即黃芪甲苷40 mg/kg，人參皂苷Rg150 mg/kg，人參皂苷Rb140 mg/kg，三七皂苷R110 mg/kg。

SOD應當以活性高為好，故在本實驗條件下，配伍劑量應以A3B2C3D3為最佳方案，即黃芪甲苷40 mg/kg，人參皂苷Rg125 mg/kg，人參皂苷Rb140 mg/kg，三七皂苷R120 mg/kg。

MDA應當以含量低為好，故在本實驗條件下，配伍劑量應以A2B3C3D2為最佳方案，即黃芪甲苷20 mg/kg，人參皂苷Rg150 mg/kg，人參皂苷Rb140 mg/kg，三七皂苷R110 mg/kg。

GSH應當以含量高為好，故在本實驗條件下，配伍劑量應以A3B3C3D1為最佳方案，即黃芪甲苷40 mg/kg，人參皂苷Rg150 mg/kg，人參皂苷Rb140 mg/kg，三七皂苷R10 mg/kg。見表3-6。

2.3 正交試驗的綜合分析

由于氧化應激指標和能量代謝指標在缺血性腦損傷中的重要性不一樣，故對各指標賦予不同權重系數：ATP為0.3，SOD為0.25，MDA為0.25（由于要求MDA值越小越好，故在計算MDA的權重計分時，將MDA結果取倒數再乘以權重系數），GSH為0.2，則綜合評分（Y）=0.3ATP+0.25SOD+0.25/MDA+ 0.2GSH，對綜合評分進行正交試驗的方差分析，結果見表7。

綜合計分分析表明：4種有效成分配伍時，各成分不同水平之間均有顯著性差異（P<0.01）。綜合計分以得分值高為好，故配伍劑量應以A3B3C3D2為最佳方案，即黃芪甲苷 40 mg/kg，人參皂苷 Rg150 mg/kg，人參皂苷Rb140 mg/kg，三七皂苷R110 mg/kg。

3 討論

中藥是通過多成分、多靶點發揮作用的。中藥有效組分的總體效應不能用每一成分單獨作用的線性疊加來表示，而是其中的有效成分綜合作用的結果。因此，根據中醫藥理論和現代中藥研究成果，將中藥有效成分合理配伍將可能發揮增強療效、減少毒副反應的作用，使藥物配伍組方實現定量化[8]。以往我們基于方劑配伍理論和藥理機制，對黃芪和三七的有效組分配伍抗腦缺血作用進行了研究，這為進一步開展三七和黃芪的有效成分配伍研究，創制成分清楚、機制明確、效應增強的中藥有效成分配伍組方奠定了實驗依據。

表3 ATP正交試驗的方差分析 （μg/g組織，n=4）

表4 SOD正交試驗的方差分析 （U/mg蛋白，n=4）

表5 MDA正交試驗的方差分析 （nmoL/mg蛋白，n=4）

表6 GSH正交試驗的方差分析 （mg/g蛋白，n=4）

表7 賦予各指標不同權重后的綜合計分的方差分析 （n=4）

腦缺血后病理變化十分復雜，主要病理生理機制有能量代謝障礙，自由基、一氧化氮（NO）和興奮性氨基酸（EAA）的神經毒作用，血腦屏障（BBB）破壞等[8-11]。腦缺血后，腦組織的主要化學能量ATP急劇減少，高能磷酸化合物生成減少，造成腦組織能量代謝障礙。同時產生大量的超氧陰離子和羥自由基，與細胞膜上脂質發生脂質過氧化反應，使GSH含量減少，SOD活性降低，以及MDA含量增加，破壞膜功能和線粒體的呼吸功能，進一步使能量生成障礙。我們根據以往的研究成果，采用正交試驗方法，對黃芪和三七苷類有效組分的四種主要有效成分進行了抗腦缺血的有效配伍研究。結果表明，黃芪甲苷、人參皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷R1配伍能增加腦組織中ATP、GSH含量和SOD活性，減少MDA的生成，對抗腦缺血再灌注損傷。提示黃芪和三七配伍抗腦缺血的作用是來自于其中有效成分合理配伍的結果，不同的有效成分可能作用于不同的靶點，從而發揮對腦缺血的綜合防治作用。綜合評價其抗氧化應激損傷和增強能量代謝的效應，我們得出：黃芪甲苷、人參皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷R1的有效配伍劑量為：黃芪甲苷40 mg/kg，人參皂苷Rg150 mg/kg，人參皂苷Rb140 mg/kg，三七皂苷R110 mg/kg。這為進一步合理利用黃芪和三七的有效成分開發有效的抗腦缺血中藥有效成分配伍復方奠定了基礎。

[1]張春霞，胡利民，康立源，等.腦缺血氧化應激損傷及中藥拮抗作用研究進展[J].中華中醫藥學刊，2007，25(12)：2 509-2 511.

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[3]譚 華，黃小平，鄧常清.黃芪總苷和三七總皂苷配伍對小鼠缺血再灌注腦組織氧化應激的影響 [J].中西醫結合學報，2010，8(5)：448-452.

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（本文編輯 楊 瑛）

The Combination Study of Astragaloside IV,Ginsenosides Rg1,Rb1and Notoginsenoside R1on Antagonizing Oxidative Stress Injury and Promoting Energy Metabolism after Ischemia-reperfusion in Mice

HUANG Xiaoping,WANG Bei,QIU Yongyuan,ZENG Rong,DENG Changqing,TANG Yinghong*
(Molecular Pathology Laboratory of Hunan University of Chinese Medicine,Key Laboratory of Hunan Province for Prevention and Treatment of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine on Cardio-cerebral Diseases,Key Laboratory of Hunan Universities for Cell biology and Molecular techniques,Changsha,Hunan 410208,China)

astragaloside IV; ginsenoside Rg1; ginsenoside Rb1; notoginsenoside R1;combination;cerebral ischemia-reperfusion;oxidative stress;energy metabolism

R743.31，R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2014.07.002.005.07

2013－03－24

國家自然科學基金資助項目(81102557)；教育部2010年度高等學校博士學科點專項科研基金資助項目(20104323110001)；湖南省高校創新平臺開放基金資助項目(11K050)；湖南省教育廳一般項目(11C0963)；湖南省中醫藥管理局重點項目（201301）；湖南省科技廳一般項目（2014SK3001）。

黃小平，女，副教授，主要研究方向為心腦血管疾病的防治研究。

*唐映紅，女，碩士研究生導師，教授，E-mail：dchangq@sohu.com。

〔Abstract〕Objective To study the combination relativity among Astragaloside IV, Ginsenoside Rg1,Rb1and Notoginsenoside R1againstischemia-reperfusion injury through oxidative stress and energy metabolism,expliciting the effective combination dose.Methods Using L9(34)orthogonal experimental method,C57BL/6 mice were randomly grouped,treated for 3 d.At 1 h after the last administration,bilateral common carotid artery (CCA)were occluded with artery clip for 20 min followed by reperfusion for 30 min,to detect the contents of adenosine triphosphate (ATP),glutathione (GSH),malondialdehyde (MDA)and the activity of superoxide dismutase(SOD)in brain tissues.Results Astragaloside IV,ginsenosides Rb1,Rg1and notoginsenoside R1increased the contents of GSH,ATP and the activity of SOD,decreased MDA content,having inhibitory effect on oxidative stress injury after cerebral ischemia-reperfusion and improving energy metabolism ofbrain tissues.Fouractive components combination potentiated the effect against cerebral ischemia-reperfusion injury. Conclusion The effective combination dose of four active component antagonizing oxidative stress injury and improving energy metabolism after ischemia-reperfusion in mice was Astragaloside IV 40 mg/kg,ginsenosides Rg150 mg/kg,ginsenosides Rb140 mg/kg,notoginsenoside R110 mg/kg, respectively.