基于高通量測序的寒地沼氣池微生物群落解析

趙 光，馬 放，孫 婷，李樹本，游 空，趙 貞

基于高通量測序的寒地沼氣池微生物群落解析

趙 光1，2，馬 放1，2，孫 婷3，李樹本4，游 空4，趙 貞1，2

（1.哈爾濱工業大學城市水資源與水環境國家重點實驗室，150090哈爾濱；2.哈爾濱工業大學市政環境工程學院，150090哈爾濱；3.遼寧工業大學化學與環境工程學院，121001遼寧錦州；4.海林農場，150000黑龍江牡丹江）

為實現寒地沼氣發酵系統高效、穩定運行，應建立基于沼氣發酵微生物群落的復合調控策略.本研究耦合454高通量測序和PCR-DGGE分析方法，對北方規模最大的海林農場沼氣池內細菌及產甲烷古菌群落結構進行解析.取沼氣池穩定運行期沼液樣品，分析系統內微生物群落多樣性.結果顯示，共獲得1 297條高質量微生物序列，在屬和種的分類水平上，至少存在581個細菌屬和666個細菌種.優勢菌群有Firmicutes、Bacteroidetes及Proteobacteria，相對豐度分別為46.39%、21.41%和18.98%.優勢屬（相對豐度＞5.0%）包括Proteiniphilum、Spirochaeta和Wolinella．DGGE分析結果表明，產甲烷古菌包括Methanocorpusculum sp.、Methanosaeta sp.、Methanobacterium sp.及Methanosarcina sp..，表明沼氣池的產甲烷途徑以乙酸代謝類型為主，水解、酸化過程主要由來自動物消化系統內的細菌完成．

沼氣；微生物群落；海林農場；牛糞；454焦磷酸測序技術

應用厭氧生物技術處理農業廢棄物產沼氣，可以作為石化能源的替代能源，而且對于改善農村環境質量、調整能源消費結構等均具有重要意義［1-2］.厭氧發酵產沼氣是一系列復雜的生物學過程，在有機物降解的不同階段都會由具有相應功能的微生物作用.這些微生物的代謝過程相互抑制，同時相互依存，共同維系厭氧發酵系統的穩定運行［3］.有機物厭氧發酵的產甲烷過程中，非產甲烷菌群和產甲烷菌群既相互競爭，又相互依存.水解、產酸菌群為產甲烷菌群提供產甲烷底物基質，同時如果產酸代謝旺盛就會嚴重抑制產甲烷菌群的活性；產甲烷菌群也為水解、產酸菌群的正向代謝解除反饋抑制，并創造熱力學上的優越條件.因此，調控厭氧消化系統內兩大功能菌群的代謝平衡是獲得穩定、高效產氣率的關鍵.深入解析厭氧發酵系統微生物多樣性和群落結構，對于厭氧發酵系統的升級改造及工藝優化均有重要指導作用.近年來，國內外學者基于傳統的分子生物學技術，對厭氧發酵系統的微生物群落開展了大量研究，也發現了一些典型的參與厭氧發酵過程的微生物［4-6］.但由于技術手段的局限性，無法對發酵過程微生物群落結構進行全面深層次的研究和解析.

高通量測序技術已廣泛應用于各學科研究，拓寬了對于環境微生物研究的尺度與深度.目前，普遍應用的大規模高通量測序平臺主要有Roche公司的454焦磷酸測序技術（454 pyrosequencing technology）、ABI公司的SOLiD（supported oligo ligation detetion）以及Illumina公司的Solexa等.此外，深入解析厭氧發酵系統運行過程中微生物群落結構的動態演替及功能的改變，對于研究系統運行不穩定機理及制定有效調控策略，使其實現高效、穩定運行具有重要意義［7］.本研究以北方寒地最大的沼氣發酵系統——黑龍江海林農場沼氣池為研究對象，耦合454焦磷酸高通量測序和PCR-DGGE分析技術，解析其穩定運行時的微生物多樣性和群落結構組成.以期為運行工藝的優化、系統升級改造、提高冬季甲烷轉化效率以及制定高效的調控策略提供理論參考.

1 實 驗

1.1 沼氣池發酵原料及運行參數

海林農場沼氣發酵系統生產模式如圖1所示，沼氣池總容積1 920 m3，由8個分隔池體組成.發酵原料為牛糞，主要來自農場圣澳奶牛養殖場.沼氣池以半連續發酵工藝運行，干物質質量分數8%，發酵溫度為35℃，內置機械攪拌系統，間歇式啟動；有機負荷（organic loading rate，OLR）和水力停留時間（hydraulic retention time，HRT）分別為2 kg·m-3·d-1和50 d，日均沼氣產量1 200 m3.

圖1 海林農場沼氣發酵系統生產模式

1.2 樣品采集

樣品采集于沼氣池產氣的穩定運行期，使用50 mL離心管于沼氣池出料口處收集，厭氧封存后轉移至冰盒，迅速帶回實驗室-20℃保存.

1.3 實驗方法

1.3.1 微生物群落結構解析

樣品自然融化后，以500 r／min離心30 s，棄沉淀后待用.基因組DNA應用Fast DNA SPIN Kit（Qbiogene Inc.）按照操作說明提取.

1.3.2 細菌群落結構解析

細菌16S rRNA V3高變區DNA擴增采用通用引物對341f和534r.引物序列如表1所示，下劃線序列為454焦磷酸測序時區分各樣品所加7個堿基的唯一編碼序列標記.PCR擴增體系包括:模板DNA 50 ng，1X buffer，3 mmol／L MgCl2，每種引物10 pmol，0.4 mmol／L dNTP及1.25 U TaKaRa Ex Taq?HS.PCR擴增條件為94℃預變性5 min，95℃變性45 s，57℃退火30 s，72℃延伸45 s，30個循環，最后72℃延伸5 min.擴增產物使用FLX 454 System測序，由國家人類基因組南方研究中心協助完成.

表1 16S rRNA細菌通用引物

所測得序列根據樣品唯一的tag標記區分，使用RDP-II Classifier數據庫將序列進行遺傳分類（從Genus到Phylum）［8］.相似矩陣（distance matrices）、聚類分析（cluster）、稀釋曲線（rarefaction curve）、Shannon-Weaver指數、覆蓋率（coverage estimator）、豐富度指數Chao1和ACE等應用mothur software計算（http:／／www.mothur. org／wiki／Sogin-data-analysis）［9］.

1.3.3 產甲烷古菌群落結構解析

產甲烷古菌V2-V3區擴增使用通用引物對A109（T）-F和515GC-R［10］.PCR擴增體系（50 μL）包括:模板DNA 100 ng，1X buffer，3 mmol／L MgCl2，20 pmol每種引物，0.4 mmol／L dNTP，1.25 U Taq DNA聚合酶.PCR擴增條件為94℃預變性3 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，30個循環，最后72℃延伸5 min.所有PCR反應使用GeneAmp PCR System 9700完成（Applied Biosystems，CA，USA）.

DGGE應用30%～50%的梯度膠，凝膠PCR產物點樣后于60℃、75 V電泳16 h后銀染.將切膠后的條帶樣品回收、純化，PCR產物與pGEM-T載體連接，轉化JM109，隨機挑取克隆，進行轉化子鑒定后測序.所得序列通過Genbank數據庫的BLASTX功能進行分析比對.序列的線性及多重比對使用Clustal-X軟件完成，系統發育進化樹使用Mega 4.0以Neighbor-Joining算法構建，自評1 000次［11］.

2 結果與討論

2.1 沼氣池細菌群落多樣性分析

為獲取更多沼氣池穩定運行期細菌群落多樣性信息，利用454高通量測序技術對細菌16S rRNA的V3高變區進行擴增，序列比對后分析種群多樣性和結構組成.經序列質量篩選，去除堿基錯配、缺失、含（N）序列及短序列等，獲得高質量序列1 297條.

2.1.1 細菌多樣性評價

通量測序的數據分析一般將不同序列在同一相似水平下歸類于同一操作分類單元（operational taxonomic unite，OTU）.如表2所示，當序列相似度為95%和97%時，分別產生581個和666個OTU，覆蓋率分別為66.8%和60.4%，說明沼氣池穩定運行時至少存在581個細菌屬和666個細菌種，細菌群落多樣性非常豐富.豐富度指數Chao1和ACE是反映物種群落豐欠狀況的指標，本研究計算結果顯示，在屬分類水平沼液樣品Chao1和ACE分別為1 937和3 745.豐富度指數分析同樣表明，測序數量未能達到飽和，繼續擴大測序通量仍可發現新的物種.

表2 細菌在不同分類水平的多樣性及豐富度指數統計

圖2為沼液樣品細菌群落在不同分類水平下的稀釋曲線，取95%為置信區間，以每次隨機挑選10條序列進行累加的方法計算.可以看出，起初隨著測序數量的增加，OTU數量迅速增加；隨著測序序列數量的進一步增大，各分類水平下OTU數目的增加趨于平緩，但仍未達飽和.稀釋曲線的平滑程度越高，表明對環境樣品微生物的覆蓋率越高.

圖2 沼液樣品稀釋曲線

2.1.2 細菌群落組成的系統發育分析

本研究從沼氣池沼液樣品中獲得1 297條高質量有效微生物序列，根據系統發育分析，序列相似度cutoff=0.3時的聚類分析，可產生666個OTU，即沼氣池中存在666個細菌種（species），相比傳統常用微生物研究的分子生物學手段，DGGE和克隆文庫技術體現出巨大優勢.由于傳統分子生物學技術基于Sanger測序法，一個宏基因組樣品聚類分析后獲得的OTU數小于50，極大阻礙了準確了解群落結構的組成.本研究在種的分類水平上，獲得的OTU數相比傳統技術增加了10倍以上，充分顯示出高通量測序技術的優越性.

如圖3（a）所示，沼氣池沼液樣品細菌多樣性十分豐富，在門分類水平上屬于13個類群，主要包括:脫鐵桿菌門（Deferribacteres）、揉膜菌門（Tenericutes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、藍藻門（Cyanobacteria）、Synergistetes門、放線菌門（Actinobacteria）、纖維桿菌門（Fibrobacteres）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、綠菌門（Chlorobi）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、螺旋體門（Spirochaetes）和變形菌門（Proteobacteria）.優勢類群為Firmicutes、Bacteroidetes和Proteobacteria，相對豐度分別占細菌群落的46.39%、21.41%和18.98%.處于次優勢地位的類群為Spirochaetes和Fibrobacteres，相對豐度分別占細菌群落的8.27%和3.17%.

如圖3（b）所示，沼液樣品在綱分類水平屬于20個微生物類群，其中優勢類群主要有（相對豐度＞2.0%）:梭菌綱（Clostridia）、擬桿菌綱（Bacteroidia）、ε-變形菌綱（Epsilonproteobacteria）、芽孢桿菌綱（Bacilli）、螺旋體綱（Spirochaetes）、β-變形菌綱（Betaproteobacteria）、纖維桿菌綱（Fibrobacteria）和γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria），相對豐度分別占細菌群落的36.60%、19.11%、11.52%、8.79%、8.70%、5.29%、3.50%和2.05%.

圖3 沼氣池細菌在門和綱分類水平的微生物組成

在屬分類水平，優勢類群主要包括（相對豐度＞2.0%）:Proteiniphilumsp.（7.33%）、Spirochaeta sp.（6.78%）、Wolinella sp.（5.86%）、Coprococcussp.（4.16%）、Arcobacetrsp.（3.86%）、Fibrobactersp.（3.47%）、Tetrathiobacter sp.（2.93%）、Lysinibacillus sp.（2.47%）、Bacillus sp.（2.24%）和Bacteroides sp.（2.16%）（表3）.

表3 沼氣池樣品中相對豐度高于0.5%微生物OTU組成

2.2 沼氣池產甲烷古菌多樣性分析

為研究沼氣池穩定運行期產甲烷古菌群落結構，提取沼液細菌基因組DNA，對產甲烷古菌16S rRNA V2-V3區PCR擴增后，擴增產物進行變性梯度凝膠電泳.DGGE圖譜如圖4所示，圖譜中包含12個優勢條帶，對優勢條帶進行DNA膠回收后，進行基因克隆測序.由條帶的相對豐度可知，Band 2、Band 3和Band 12是最優勢類群.系統進化分析表明，沼氣池產甲烷古菌主要分布在3個目，即甲烷八疊球菌目（Methanosarcinales）、甲烷微菌目（Methanomirobiales）和甲烷桿菌目（Methanobacteriales）.核酸序列比對結果顯示，沼氣池產甲烷古菌包括Methanocorpusculum sp.、Methanosaetasp.、Methanobacteriumsp.及Methanosarcina sp.（表4）．其中，Methanosaeta sp.和Methanosarcina sp.是沼氣池內最優勢產甲烷菌．

圖4 沼氣池產甲烷古菌V2-V3區PCR產物DGGE圖譜

3 討 論

深入解析生物反應器的微生物群落結構，可揭示其在運行過程中的運行特征及已知的功能微生物群落結構和未知群落之間存在的關系.應用454焦磷酸高通量測序技術研究沼氣池穩定運行期沼液樣品細菌群落結構，得到了較高的覆蓋率，共獲得1 297條高質量16S rRNA基因序列，覆蓋率在屬水平可達66.8%.相比傳統分子生物學手段獲得了更全面、準確的微生物群落信息.其中最優勢類群屬于Firmicutes（46.39%）、Bacteroidetes（21.41%）和Proteobacteria（18.98%），占序列總數的86%以上.在屬的水平上，優勢類群包括Proteiniphilumsp.（7.33%）、Spirochaetasp.（6.78%）和Wolinella sp.（5.86%），均屬動物消化系統內常見微生物類群.由此可知，沼氣池有機底物水解、產酸過程的主要功能微生物來源于牛消化系統內的細菌類群，并未演替為具有較強有機物降解能力的Bacillus sp.、Clostridium sp.和Acinetobacter sp.等，以及揮發酸轉化能力較強的Syntrophomonassp.、Ruminococcussp.和Desulfotomaculum sp.等微生物類群［12-14］.由于沼氣池采用的是單相混合發酵工藝運行，揮發性脂肪酸的轉化速率仍是產甲烷效率的限速步驟.此外，以Proteiniphilum sp.、Spirochaeta sp.和Wolinella sp.為優勢類群的群落結構，影響了底物的降解和產酸速率，這也是造成沼氣池產氣量不高的主要原因之一.

很多研究證實，Bacteroidetes包括很多具有降解長鏈脂肪酸功能的微生物類群，在降解長鏈脂肪酸時具有重要作用［15］.一些長鏈脂肪酸，如十二烷酸、油酸、辛酸和豆蔻酸等，尤其是十二烷酸是毒害作用最強的長鏈脂肪酸.Wang等［16-17］在CSTR厭氧消化牛糞、牛糞與少量秸稈混合產甲烷過程中以及處理一些富含糖類物質的廢棄物時發現Bacteroidetes為優勢菌群.當OLR增加時Clostridiaceae一類菌群增加，這表明系統內微生物代謝由脂肪酸轉化轉變為有機底物的降解.Lee等［18］在應用焦磷酸通量測序技術對大規模混合及兩相工藝中溫處理剩余污泥產甲烷研究時發現，優勢種群為Proteobacteria（20.5%）、Bacteroidetes（19.7%）、Firmicutes（17.8%）和Chloroflexi（4.8%）.Godon等［19］研究應用蒸酒廢物產甲烷時發現，最優勢類群屬Firmicutes，其次為Bacteroidetes和Proteobacteria.這一結論與本研究相似，Bacteroidetes在很多中溫發酵產甲烷系統中均為優勢種群，表明與有機物降解的水解、酸化過程緊密相關［20］.

應用PCR-DGGE對沼氣池產甲烷古菌多樣性進行分析，結果表明，優勢產甲烷類群主要分布在Methanosarcinales、Methanomirobiales和Methanobacteriales.由條帶相對豐度可知，Methanosaeta sp．和Methanosarcina sp.是沼氣池內優勢產甲烷古菌，均為乙酸營養型產甲烷古菌.由此可知，沼氣池以利用乙酸產甲烷途徑為主要代謝方式.利用H2及甲酸鹽為電子供體的Methanobacterium sp．和Methanocorpusculum sp.，在維持乙酸營養型產甲烷系統穩定運行中也具有重要作用.Rastogi等［21］研究夏季以牛糞為發酵底物產沼氣系統中產甲烷菌群多樣性時發現，優勢產甲烷古菌為Methanomicrobiales、Methanosarcinales和Methanobacteriales，分別占序列總數的41.7%，30%和19%.此外，Methanosarcina sp.穩定存在于厭氧發酵系統，也十分有利于低溫條件下厭氧發酵系統的穩定運行.

由此可見，如何調控微生物成為降解和產酸能力較強的群落組成結構及活性較強的產甲烷菌類群，是提高系統運行效率的關鍵.為使厭氧消化系統高效運行及調控，可進行生物相的分離，使有機底物的降解和產酸過程與產甲烷過程分離，提高系統的穩定性.此外，通過調整運行參數、底物性質及投加外源菌群調控等策略，使產酸系統微生物類群由動物消化系統內微生物類群主導的組成過渡為對纖維類底物降解能力更強的群落組成，提高底物降解及揮發性有機酸的轉化效率，同時適當調整產甲烷相的運行參數，提高產甲烷效率.

4 結 論

1）本研究利用454焦磷酸高通量測序技術，對北方規模最大的海林農場沼氣池細菌群落進行多樣性與結構解析，得1 297條高質量細菌序列，在屬分類水平上的覆蓋率為66.8%，至少存在581個細菌屬.

2）聚類分析結果表明，沼氣池細菌包括13個細菌門，最優勢類群為Firmicutes，其次為Bacteroidetes和Proteobacteria.在屬分類水平上，Proteiniphilum sp.為最優勢微生物類群，其次分別為Spirochaeta sp.和Wolinella sp..

3）DGGE條帶分析表明，沼氣池產甲烷菌包括Methanocorpusculum sp.、Methanosaeta sp.、Methanobacterium sp.及Methanosarcina sp.，其中Methanosaeta sp.和Methanosarcina sp.是沼氣池內優勢產甲烷菌.

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（編輯 劉 彤）

Analysis of microbial community in a full-scale biogas digester of cold region using high-throughput sequencing technology

ZHAO Guang1，2，MA Fang1，2，SUN Ting3，LI Shuben4，YOU Kong4，ZHAO Zhen1，2
（1.State Key Lab of Urban Water Resource and Environment，Harbin Institute of Technology，150090 Harbin，China；2.School of Municipal and Environmental Engineering，Harbin Institute of Technology，150090 Harbin，China；3.School of Chemical and Environmental Engineering，Liaoning University of Technology，121001 Jinzhou，Liaoning，China；4.Hailin Farm，150000 Mudanjiang，Heilongjiang，China）

To realize the stable and efficient operation of biogas digester in cold region，a combined regulation technique of microbial community should be established.The microbial community in the largest full-scale digester of Hailin Farm was investigated using 454 pyrosequencing technology and PCR-DGGE.The massively parallel sequencing technology was used to measure bacterial diversity of biogas slurry during a stable operation.A total of 1297 sequences were obtained，and the dominant bacteria were Firmicutes，Bacteroidetes and Proteobacteria，which accounted for 46.39%，21.41%and 18.98%，respectively.At genus level（the relative abundances＞5.0%），Proteiniphilum，Spirochaeta and Wolinella were the abundant taxa.The diversitiesofmethanogenwereanalyzedusingPCR-DGGE，andthedetectedarchaeawere Methanocorpusculum sp.，Methanosaeta sp.，Methanobacterium sp.and Methanosarcina sp..Notably，the methane produced by acetoclastic methanogens，and dominant fermentative bacteria during the hydrolysis and acidogenesis were detected form animal digestive system.

biogas；microbial community；Hailin Farm；cow manure；454 pyrosequencing technology

X705

A

0367-6234（2014）04-0036-07

2013-03-20.

國家科技支撐計劃專題項目（2012BAD14B06-04）；遼寧工業大學教師科研啟動基金資助項目（X201310）.

趙 光（1980—），男，博士研究生；

馬 放（1963—），男，教授，博士生導師.

馬放，mafang＠hit.edu.cn；孫婷，suntinghit＠126.com.