結核分枝桿菌抗原特異反應性白細胞介素—22在結核性胸膜炎鑒別診斷中的應用

原艷明等

[摘 要] 目的：研究胸液單個核細胞經結核分枝桿菌特異性抗原肽刺激后表達的白細胞介素-22（Interleukin-22，IL-22）濃度測定在結核性與惡性胸腔積液鑒別診斷中的價值。方法：將確診的52例結核性胸膜炎和35例惡性胸腔積液患者胸液單個核細胞分離后，使用結核分枝桿菌特異抗原肽（early secreted antigenic target-6，ESAT-6）、（culture filtrate protein-10，CFP-10）刺激培養，測定細胞培養液上清中IL-22和干擾素-γ（Interferon-γ，IFN-γ）濃度，對結果進行統計學分析。結果：結核性胸膜炎組IL-22濃度明顯高于惡性胸液組（P<0.01）。ROC曲線顯示IL-22用于結核性胸膜炎的診斷敏感性、特異性和準確性分別為90.38%、80.56%和85.23%，其診斷效能與IFN-γ相當（P>0.05）。結論：結核分枝桿菌抗原特異反應性IL-22測定可作為對結核性胸膜炎診斷的重要參考指標。

[關鍵詞] 白細胞介素-22；結核性胸膜炎；惡性胸水；鑒別診斷

中圖分類號：R521.7 R446.62 文獻標識碼：A 文章編號：2095-5200（2014）03-001-03

[Abstract] Objective：To research the diagnosis value of the measurement of the concentration of Interleukin-22（IL-22）generated by the pleural fluid mononuclear cells（PFMCs）stimulated by specific MTB antigen peptides in tuberculous Pleurisy effusions（TPE）and malignant pleural effusions（MPE）. Methods： The pleural fluid mononuclear cells（PFMCs）of 52 cases of TPE and 35 cases of MPE were separated and cultivated with the stimulation of specific MTB antigen peptides（early secreted antigenic target-6，ESAT-6）、（culture filtrate protein-10，CFP-10）， the concentration of IL-22 and Interferon-γ（IFN-γ）of the PFMCs culture fluid supernatant were measured and the results were statistically analyzed. Results：The concentration of IL-22 in TPE group was significantly higher than MPE group（P<0.01）.ROC curve showed the sensibility 、specificity and the accuracy of IL-22 were 90.38%、80.56% and 85.23% when used in the diagnosis of TPE， the diagnose efficiency was equal to IFN-γ（P>0.05）. Conclusion： The measurement of the Mtb-antigen-specific IL-22 can be regarded as an important reference index in the diagnosis of TPE.

[Key words] Interleukin-22；Tuberculous pleurisy；Malignant pleural effusions；differential diagnosis

胸腔積液是臨床常見病癥，早期確診難度較大，目前仍依賴于特異性病原體的檢出或胸膜活檢發現典型病理改變。但由于檢出陽性率低，影響了患者獲得及時有效的診斷和治療。因此探尋靈敏度、特異度均好的檢測指標，對臨床意義重大。本文通過測定87例確診的胸腔積液患者胸液單個核細胞（pleural fluid mononuclear cells，PFMCs）表達結核分枝桿菌抗原特異反應性白細胞介素-22（Interleukin-22，IL-22）的濃度，與已廣泛應用于臨床的干擾素-γ（Interferon-γ，IFN-γ）作比較，探索其在結核性胸膜炎與惡性胸水鑒別診斷中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇解放軍309醫院2012年4月至2013年9月期間住院確診的胸腔積液患者。結核性胸膜炎組（結核組）患者52例，男34例，女18例，年齡17～76歲，平均（36±17）歲。診斷依據：1）胸液或胸膜活組織中抗酸桿菌陽性（涂片、培養或TB-DNA檢測）；2）胸膜活檢發現典型結核病變如結核性肉芽腫或干酪樣壞死物改變；3）典型臨床表現、PPD皮試陽性、滲出性胸腔積液改變、外周血淋巴細胞干擾素釋放檢測及抗結核治療有效。惡性胸腔積液組（惡性組）35例，男15例，女20例，年齡36～82歲，平均（59.9±13.7）歲。診斷依據：胸膜活檢發現惡性病變和/或胸液脫落細胞中發現惡性細胞。

1.2 方法

1.2.1 標本采集與處理 所有入組患者均在治療前，無菌操作下常規胸穿留取胸液50 mL，1800 rpm/min離心5 min，將沉淀細胞用Ficoll進行密度梯度離心，獲取PFMCs，充分洗滌后，用RPM1640完全培養液調整細胞數為1×106/mL，部分200 ?L體系細胞懸液內加入結核分枝桿菌（early secreted antigenic target-6，ESAT-6）、（culture filtrate protein-10，CFP-10）抗原肽庫（終濃度為40 ?g/mL），于5% CO2、37 ℃培養18 h后取細胞培養液上清，- 80℃保存待測。1周內完成樣品檢測。

結核分枝桿菌特異性抗原肽庫（ESAT-6，CFP-10）由北京賽百盛公司合成，純度大于95%。Ficoll密度梯度淋巴細胞分離液購自GE biosciences（USA），RPMI 1640培養液購自GIBCO（USA），細胞因子檢測試劑盒購自eBioscience；流式細胞儀為Beckman coulter PC500型。

1.2.2 IL-22和IFN-γ濃度測定 使用Flowcytomix 流式細胞儀檢測樣品。根據eBioscience細胞因子檢測試劑盒說明書操作，設陰性對照孔，主要步驟如下：將標準品、微球、生物素偶聯的檢測抗體按比例配置順次加入，避光室溫孵育2 h；清洗后按照FlowCytomix Pro 2.1分析軟件（eBioscience公司提供）計算比例加入鏈親和素-PE，避光室溫孵育1 h，再次清洗后進行流式檢測。用標準品控制組間變異，組間變異小于15%。使用FlowCytomix Pro 2.1 分析軟件讀取所得流式檢測原始LMD文件，建立各檢測因子的標準曲線后，軟件自動計算出樣品濃度，結果以pg/mL表示。

1.2.3 統計學分析 數據以中位數（四分位間距）表示。組間比較用非參數Mann-Whitney檢驗，應用受試者工作特征曲線（ receiver operating2 characteristic curve，ROC），以Youdens指數最大的截斷點為診斷結核性胸膜炎的標準，計算IL-22的診斷效能，率的比較用x2檢驗。此次試驗采用GraphPad Prism 5統計軟件處理，以P<0.05表示差異有顯著性。

2 結果

2.1 兩組細胞培養上清液中IL-22和IFN-γ測定結果

結核組PFMCs經結核分枝桿菌特異性抗原肽庫刺激后產生的IL-22濃度[1161（3279.8）] pg/mL與培養液上清液比濃度顯著升高（P<0.01），與惡性組比較，差異存在統計學意義（P<0.01），與IFN-γ檢測結果一致。見表1。

2.2 結核分枝桿菌抗原特異反應性IL-22和IFN-γ對胸腔積液的鑒別診斷價值

以Youdens指數最大的截斷點為診斷結核性胸膜炎的標準，計算IL-22和IFN-γ對結核性和惡性胸腔積液的鑒別診斷價值，表2可見兩組間差異（P>0.05）無統計學意義。

3 討論

胸腔積液是臨床常見病癥，結核性胸膜炎和惡性胸膜疾病是主要病因[1]。由于涂片檢測抗酸桿菌陽性率不足5%，結核菌培養的診斷敏感性也只有58%[2，3]，確診并非易事。尋找敏感性和特異性較高的檢測指標以輔助胸腔積液的病因診斷一直是國內外學者的研究熱點。

IL-22是Th22細胞（helper T cell 22，Th22）的主要產物[4]，也可由Th1（helper T cell 1，Th1）、Th17（helper T cell 17，Th17）、NK細胞（natural killer cell，NK cell）等多種免疫細胞表達[5]。當機體感染病毒或細菌等病原體后，IL-22能夠激活其它免疫細胞，幫助機體控制炎癥對抗感染[6]，并通過介導組織表達急性炎癥蛋白、粘蛋白或抗微生物肽等物質，使慢性炎癥中的組織保持完整[7]。在結核免疫中，IL-22可通過促進向自然殺傷細胞溶酶體傳送結核分枝桿菌，加強吞噬溶酶體的溶解作用[8]，并可能通過增加基質金屬蛋白酶（Matrix Metalloproteinases，MMPs）的表達，參與結核性胸膜炎的免疫病理[9]。Qiao D等[10]證實在結核性胸腔積液中存在結核分枝桿菌特異的Th22細胞，使用（ESAT-6、CFP-10）抗原肽刺激后，IL-22 mRNA顯著上調，表達產物增加。

結核分枝桿菌抗原特異IFN-γ檢測目前已成為一種重要的診斷結核的生物標記物。受到結核分枝桿菌抗原刺激而致敏的T細胞再次遇到同類抗原時能產生特異性IFN-γ，特異性升高的IFN-γ量可以反映體內結核特異性T細胞應答的強弱，依此可間接判斷結核分枝桿菌的感染情況[11]。抗原ESAT6、CFP10是重要的T細胞抗原，能誘導機體產生記憶性免疫應答，是致病性MTB特有而BCG缺失的片段[12]，能夠區分真性結核感染，排除BCG接種產生的干擾。

本研究以IL-22為觀察指標，使用結核分枝桿菌特異抗原肽（ESAT-6、CFP-10）刺激培養87例胸腔積液患者PFMCs，通過檢測培養液上清中IL-22的濃度，并作統計學分析，發現結核組IL-22在刺激后上清中表達水平顯著升高（P<0.05），與Qiao D研究結果一致，且結果明顯高于惡性組（P<0.05）。用于診斷結核性胸膜炎時，敏感性和特異性分別達到90.38%和80.56%，與IFN-γ診斷效能相當。因此認為，IL-22與IFN-γ類似，可作為結核病診斷金標準之外的一個非常有效的輔助診斷方法。

參 考 文 獻

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