被冰水浸泡后大鼠斷肢再植的實驗研究

周健輝，李秀文，王夫平，冷樹立

(南方醫科大學附屬小欖醫院手外科，廣東中山 528415)

·論著·

被冰水浸泡后大鼠斷肢再植的實驗研究

周健輝，李秀文，王夫平，冷樹立

(南方醫科大學附屬小欖醫院手外科，廣東中山 528415)

目的研究被冰水浸泡大腿斷肢后的不同時段對血管損傷程度的影響，為被冰水浸泡的斷指再植病例提供科學理論支持。方法實驗選用成年大鼠共20只，雌雄不限，隨機分為4組，分別把左側大腿中上1/3水平環形離斷，然后分別將斷肢冰水浸泡1 h、2 h、4 h、6 h。然后對每組斷肢血管進行病理觀察，再將不同組織別斷肢進行再植，術中觀察血管通血情況，通血0.5 h后均將血管切斷，再次對斷肢血管行病理分析，最后再次接通斷肢血運，縫合皮膚，把小鼠送回試驗室，觀察各組斷肢再植的成活率。結果血管內皮細胞在凍傷后的1 h、2 h、4 h內未見明顯損傷，但在通過恢復血流復溫后，內皮細胞就會產生不同程度的損傷。在1 h組及2 h組中，斷指再植的成活率較高，在4 h組斷肢再植成活率低，在6 h組中，無一斷肢成活。結論被冰水浸泡后的血管損傷程度隨著時間的推移而加重，浸泡的時間越長，復位后血管形成的血栓越容易，當到達6 h以上均形成不可逆性損傷。

冰水浸泡；斷肢；再植；血管損傷

被冰水浸泡后的斷腕、斷指再植成功案例在國內已經屢有報道，在本地區也遇到不少，但成活率較正常保存的低，有學者曾經用大鼠來研究斷肢不同保存方法對血管的損傷情況，但還沒有研究冰水浸泡時間長短對斷指血管的損傷以及斷肢再植成活率的影響。本實驗研究大鼠組織離體后，通過冰水浸泡保存肢體的不同時段的病理學研究，探討冰水浸泡后的不同時段對血管的損傷程度，為臨床醫生在接診有關冰水保存斷肢患者時提供手術適應證、手術操作、術后護理的參考及相關的理論支持。

1 資料與方法

1.1 動物分組及模型的建立選用成年大鼠共20只，雌雄不限，將20只大鼠分為術后離斷肢體被冰水浸泡1 h組、2 h組、4 h組、6 h組，每組大鼠5只，左側大腿為手術實驗側。

1.2 實驗過程及記錄相關數據的辦法

1.2.1 大鼠的麻醉及注意事項首次麻醉以0.3 ml/100 g的劑量行腹腔注射10%的水合氯醛，實驗手術中根據大鼠麻醉的狀態，腹腔再注射1/3的量來維持麻醉，避免大鼠產生任何自發運動，影響手術的操作，直至手術結束。

1.2.2 大鼠左側肢體的離斷固定、消毒、鋪巾，將左側大腿中上1/3水平作半環形切口，分離出股動靜脈，然后將股動靜脈離斷并結扎斷端，然后將皮膚、肌腱、神經、骨質離斷，環形離斷皮膚，然后分別將離斷肢體用冰水浸泡1 h、2 h、4 h、6 h。

1.2.3 觀察冰水浸泡后及復溫后的血管變化將每一組血在冰水浸泡所需的時間后，切取少段動脈組織，制作成病理切片，并記錄鏡下的情況。然后將大鼠斷肢的動脈與近端吻合，經復溫10 min后，取下少段動脈組織，再次制作成病理切片觀察。

1.2.4 觀察各組再植肢體的成活率將各組斷肢吻合動靜脈后，縫合皮膚，然后用夾板固定雙下肢，麻醉蘇醒后放回籠子，放置食物和水，觀察再植肢體的成活率。

2 結果

分別對各個實驗組大鼠血管的復溫前后取樣，制作成標本后在電子顯微鏡下觀察血管損傷的變化，以血管舒張、紅細胞滲出、血栓形成、內皮細胞破裂、內皮下層損傷、中膜彈性纖維損傷為闡述血管損傷程度的指標，做好相應的記錄和對比。結果顯示，復溫前后血管損傷程度隨著時間的推移而加重。分別將各試驗組的斷肢進行再植，結果顯示，隨著浸泡時間的推移，斷肢成活率明顯降低，見表1。

表1 各個實驗組大鼠離斷肢體在不同時段冰水浸泡后血管損傷情況及再植成活率

3 討論

由實驗結果證明，被冰水浸泡的肢體對血管是有損傷的，在不同時間的復溫也均有不同的損傷程度。在凍傷時由于凍-融過程的物理因素及一系列生化改變導致凍傷組織循環及血管內皮細胞損傷已被證實[1]。國內盧學春等[2]通過對凍傷大鼠內皮細胞國內改變的研究表明，在血管凍傷后ACE活性增高、人抗凝血酶-Ⅲ(AT-Ⅲ)含量及活性降低，這些指標改變與凍傷的程度有密切關系，表明凍傷后血管內皮細胞有不同程度的損傷。由于血管內皮細胞這些改變，使血液凝固性增強，血管收縮而促進凍傷組織血液循環及代謝障礙，進而導致凍傷組織壞死。就內皮細胞而言，本實驗中發現血管內皮細胞在凍傷后的1 h、2 h、4 h內未見明顯損傷，但在通過恢復血流復溫后，內皮細胞就會產生不同程度的損傷，這就說明由于凍-融這個過程會因為各種化學物質的大量釋放后，導致細胞的破裂死亡。這個機理目前也有報道是胞漿中的PGI2釋放到血液中所致[3]。所以為減少復溫后凍傷血管對內皮細胞的損傷程度，可能可通過抑制PGI2實現，但有關這方面的論據還需要進一步的論證。

實驗表明，隨著時間的推移，血管纖維層的損傷也進一步的加強，隨著肌纖維的變性，橫紋消失，大片壞死，血管壁部分壞死，部分彈性纖維的斷裂，有較多纖維素性和混合性血栓形成。在浸泡后4 h開始出現血管的擴張，經血液復溫后，情況加重，血管失去彈性張力，不利于血流的輸送。

在1 h組及2 h組中，斷指再植的成活率較高，這與斷肢浸泡時間比較短有關，經復溫后，血管損傷程度較輕，組織能自行修復，未出現組織不可逆性損傷。我們認為，在此類斷指(肢)再植中，成活率較高，應該盡一切努力進行再植，術后常規治療會得到較好的效果。

在4 h組斷肢再植成活率低，我們認為，隨著時間的推移，血管損傷的程度加重，大部分已出現不可逆性損傷。即使在手術中顯微鏡下觀察血管內壁的大致形體無太大的變化，但在接通血管復位后，血管的缺血再灌注損傷明顯，乃至發生了血管逆損傷，血管出現明顯擴張、內膜細胞的破裂導致血栓的廣泛形成。此類斷肢再植成活率不高，或者有必要進一步解決再灌注損傷的難題，更有利于斷肢再植的成活。

在6 h組中，可見無一斷肢成活，可見此時段的血管損傷最重，甚至在復溫前已出現明顯的血管損傷現象，經接通血管復溫后，由于灌注的進一步損傷，另血管結構徹底的破壞，導致血管栓塞，肢體壞死。

目前在血管凍傷微循環變化方面有很多研究[4-9]，但由于各家的方法、條件及動物的模型不同，導致實驗結果缺乏可比性，甚至相互矛盾。事實證明凍傷微循環的研究已不限于微血管結構、功能狀態的改變以及血流狀態的改變，同時與血管內皮細胞、血細胞的功能及二者之間的相互作用。通過以上實驗組的結果，只能重某方面闡明局部冰水直接凍傷血管內皮細胞產生的后果，可以得出該種模式下的血管凍傷與時間段的關系。對于整體的血管凍傷微循環變化還有待于進一步的研究。

[1]Bourne MH,Piepkorn MW,Clayton F,et al.Analysis of micro vas-cular change in frostbite injury[J].J Surg Res,1986,40(1):26.

[2]盧學春,李鳳芝,遲小華,等.免疫復合物參與凍傷大鼠凍結-融化損傷的研究[J].中國應用生理學雜志,2006,22(4):645-646.

[3]孔煒,方華豐,王迪潯,等.急性缺氧對肺動脈內皮細胞血栓素合酶基因表達及PGI2、TXA2代謝產物的影響[J].同濟醫科大學學報,2001,30(4):295-297.

[4]楊增仁,杜桂仙.凍傷微循環研究概況[J].循環醫學雜志,l996,6 (4):43-45.

[5]李鳳芝,顏培華、劉友梅,等.凍傷大鼠血管內皮細胞功能改變的研究[J].中華創傷雜志,1994,10(6):280-281.

[6]張中興,辛素賢,彭長營.重度凍傷試驗模型的研究[J].中華醫學雜志,1980,60(11):673-675.

[7]閻紅,賴西南,葛衡江,等.兩種復合戰傷合并海水浸泡對血管內皮損傷的比較研究[J].中華航海醫學與高氣壓醫學雜志,2010, 31(4):521-522.

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[9]姜忠華,王少春,王全平,等.低溫海水淹溺大鼠血氣與額葉皮層前列腺術和降鈣素基因相關肽的變化[J].中華勞動衛生職業病雜志,2003,21(5):381-382.

Experimental study of rat limb replantation of ice water immersion.

ZHOU Jian-hui,LI Xiu-wen,WANG Fu-ping,LENG Shu-li.Department of Hand Surgery,Xiaolan People's Hospital Affiliated to Southern Medical University, Zhongshan 528415,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo study the effect of different periods of ice water immersion on the vessel injury degree,and to provide scientific theoretical support for rat limb replantation of ice water immersion.MethodsTwenty adult rats,regardless of gender,were selected and randomly divided into four groups,which were soaked in ice water for 1 hour,2 hours,4 hours,6 hours after the left leg in 1/3 horizontal ring off,respectively.Then pathological analysis was performed on each limb vessel,then the limb was replanted.The blood flow was observed,and the vessel was cut off again after half an hour.Based on pathological analysis,the limb blood circulation was restored and the skin was sutured.Then the rats were sent back to laboratory to observe the survival rate of limb replantation.ResultsVascular endothelial cells were found no obvious damage after 1 h,2 h,4 h of ice water immersion,but showed different degrees of damage after rewarming by the restoration of blood flow.The survival rate of replantation was relatively higher in 1 h group and 2 h group,lower in 4 h group,with no limb survival in 6 h group.ConclusionThe vascular inju-ry degree increases with the time of ice water immersion.The longer the immersion time,the easier the formation of blood vessels after reset thrombosis,The damage is irreversible after 6 hours ice water immersion.

Ice water immersion;Severed limb;Replantation;Blood vesse Injury

R-332

A

1003—6350（2014）03—0317—03

2013-05-29)

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.03.0124

周健輝。E-mail：zjhlxw@163.com