MALDI—TOF—MS技術在血液系統疾病中的應用進展

張青宜

doi：10.3969/j.issn.1007-614x.2014.11.1

摘 要 蛋白質是人類執行生命活動的直接載體，對于蛋白質的深入研究，不但有助于全面闡釋生命活動的本質，而且對于研究疾病發生機制、提前預警以及診斷疾病、療效的預后預測均具有重要意義。基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）技術是目前蛋白質組學研究中經常用到的質譜研究技術之一，已經廣泛應用于臨床研究。現就其在血液系統疾病中的應用進展進行總結。

關鍵詞 MALDI-TOF-MS 血液系統疾病 應用進展

Application progress of MALDI-TOF-MS technology in the blood system diseases

Zhang Qingyi

Department of Hematology，the People's Liberation Army General Hospital（Beijing） 100853

Abstract Protein is the direct carrier of human life activities.For depth research on protein，it not only helps to explain the essence of life activity，but also have important significance on the study of the mechanism of diseases，early warning，diagnosis of the disease and the prediction of curative effect.At present，matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry（MALDI-TOF-MS） technology is one of the frequently used mass spectrometry techniques in proteomics research.It has been widely used in clinical research.We summarize the application progress of it in the blood system diseases.

Key words MALDI-TOF-MS；Blood system diseases；Application progress

對于蛋白質的深入研究，不但有助于全面闡釋生命活動的本質，而且對于研究疾病發生機制、提前預警以及診斷疾病、療效、預后預測均具有重要意義[1]。基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）技術是目前蛋白質組學研究中經常用到的質譜研究技術之一，從中可以尋找疾病相關的生物標志物[2]。近年來已有多位學者將其應用于血液系統疾病的診斷及監測中，現就其在血液系統疾病中的應用進展進行總結。

MALDI-TOF-MS技術

技術組成：主要有三部分構成：①基質：主要作用是在吸收激光能量同時使待測的樣品分子轉化成離子，即樣品分子的離子化。②基質輔助激光解吸電離離子源（MALDI）：MALDI的作用原理是樣品與基質形成的共結晶薄膜受到激光照射后，基質吸收激光能量并將其傳遞給生物分子，而電離過程中將質子轉移到生物分子或從生物分子得到質子，從而使生物分子電離。③飛行時間質量分析器（TOF）：TOF的作用原理是氣化狀態下的離子在電場作用下加速飛過飛行管道，根據到達檢測器的飛行時間不同而被檢測，即測定離子的質荷比（M/Z）與離子的飛行時間。

基本原理：將磁珠分選后的含有微量蛋白質的樣本分散在過量的小分子基質中，將混合液體點到樣品靶上，靜置風干后放入離子源內；當靶點受到激光照射時，基質吸收激光的能量躍遷到激發狀態，樣品解吸附，基質-樣品之間發生電荷轉移使得樣品分子電離和氣化，在高電壓場內，將電離的樣品分子從離子源轉送到質量分析器內，根據到達檢測器的飛行時間不同（即通過離子的質量電荷之比（M/Z）與離子的飛行時間成正比來分析離子，并測得樣品分子的分子量），經離子檢測器及計算機數據處理得到肽質量指紋圖譜。由于每種蛋白質都有不同的氨基酸序列（一級結構），蛋白質酶解產生的肽片斷序列也不全相同，其肽混合物質量數具有特征性。比較質譜分析中所得的肽質量指紋譜與多肽蛋白數據庫中蛋白質的理論肽段，就可以對所測蛋白質進行鑒定。

MALDI-TOF-MS在血液系統疾病中的應用

急性白血病：急性白血病是嚴重威脅人類健康的惡性血液系統疾病之一，目前發病率有逐年增高趨勢。早發現、早診斷可以進行早期干預疾病進程，對于改善患者預后具有重要意義。目前已經有多位學者將MALDI-TOF-MS技術應用于急性白血病的診斷。鄭瑞璣等[3]應用MALDI-TOF-MS技術研究了51例急性白血病患者和10名健康志愿者的外周血血清蛋白質譜的表達情況，發現急性白血病患者外周血血清中存在多種蛋白質的差異表達，其中血清外源性凝集素的表達差異可作為初診急性白血病診斷標志或者預后指標。田帥等[4]應用蛋白質組技術研究了急性髓系白血病（AML-M2a）患者誘導治療前與復發者首次持續完全緩解時間具有明顯差異的白血病細胞蛋白質的表達情況，質譜鑒定了6個差異蛋白質，分別為微管蛋白特定分子伴侶B、髓過氧化物酶、轉膠蛋白2CH結構域、谷胱苷肽S-轉移酶、鋅酯蛋白、3-磷酸甘油醛脫氫酶，經統計學分析發現它們的表達水平與患者預后相關。崔久嵬等[5]同時利用MALDI-TOF-MS技術研究了急性非淋巴細胞白血病（ANLL）與急性淋巴細胞白血病（ALL）細胞差異蛋白質組表達情況，差異表達蛋白中髓系相關蛋白8和14不僅可以作為區別ANLL和ALL的分子標志，還可以區分ANLL細胞的分化階段；Op18、熱休克蛋白27等還可以作為新的分子標志區分ANLL和ALL。

MALDI-TOF-MS技術不僅應用于急性白血病的分類診斷，也可用于判斷疾病療效、微小殘留病變檢測、鑒別白血病細胞的耐藥性。梁婷婷[6]等采用基于磁珠分離的MALDI-TOF-MS技術研究了30例初發急性白血病及其治療緩解后血清標本，并獲得血清多肽譜圖，共得到具有統計學意義（P<0.05）的差異峰27個，其中治療緩解后表達上調峰及下調峰分別為10個和17個，利用上述差異峰建立的診斷模型獲得了100%敏感性和90%的特異性，認為該項技術可用于急性白血病療效評價和發病機制研究。宋偉等[7]利用血清多肽圖譜技術篩查出質荷比（m/z）為4468的多肽在初治AL患者中表達明顯增高，而良性血液病患者中未見此現象，認為其可以用于AL患者MRD的檢測、個體化治療及預測復發。

多發性骨髓瘤：多發性骨髓瘤（MM）是一種起源于B淋巴細胞的漿細胞惡性腫瘤，其診斷目前需依靠臨床表現、實驗室檢查、影像學等協同判斷，基于單一實驗室的實驗結果較難作出診斷。目前已有多位學者將MALDI-TOF-MS技術應用于多發性骨髓瘤臨床研究中，He A應用MALDI-TOF-MS技術研究了48個MM患者及74個健康人的血清樣本，鑒定出的4個具有高分離特征的譜峰組成神經網絡診斷模型，驗證階段的敏感性86.36%及特異性87.5%[8]。房亞哲等[9]通過對多發性骨髓瘤患者的骨髓上清液、血清及尿液研究后，成功篩查出與MM相關的多種差異表達蛋白，為進一步研究MM發生發展機制，完善MM診斷、鑒別診斷提供了參考依據。難治復發的多發性骨髓瘤患者大多與多藥耐藥現象相關，如何提前預知腫瘤細胞耐藥并適時調整用藥方案是當前臨床遇見的難題。王劍利等[10]利用MALDI-TOF-MS技術對比分析臨床上難治復發與治療敏感的多發性骨髓瘤（MM）患者血清蛋白質組的差異，共得到59個有明顯差異的多肽峰，將其中的10個質譜峰建成診斷遺傳算法模型，其驗證的靈敏度及特異性均100%，認為該方法可用于研究多發性骨髓瘤的耐藥機制和臨床預后判定。

骨髓增生異常綜合征：骨髓增生異常綜合征（MDS）是以骨髓無效造血及高危轉化為急性白血病為臨床表現的一組異質性克隆性疾病，臨床表現與部分巨幼細胞性貧血、再生障礙性貧血、溶血性貧血相似，診斷主要依靠細胞形態學及遺傳學相結合，尚未發現特異性的生物標志物。鐘立業等[11]利用MALDI-TOF-MS技術研究了16例MDS患者及10例正常人的血清蛋白標本，利用12個有差異的蛋白峰建立起一個MDS診斷模型，其識別準確率和交叉驗證敏感性分別達93.27%和89.94%，可以區分MDS與正常人，有助于MDS的臨床輔助診斷。鐘立業等還研究了RAEB型MDS、急性髓性白血病（AML）和正常人的血清蛋白標本各10例，通過MALDI-TOF-MS測定標本的蛋白質譜圖，對比分析差異蛋白峰，并構建診斷模型，驗證結果顯示模型的MDS識別準確率達100%，敏感性達89.42%，認為利用MALDI-TOF-MS技術能夠有效地區分RAEB患者、AML患者和正常人。根據血清差異蛋白質的組合峰所構建的診斷模型可輔助RAEB型MDS的診斷[12]。

鐮狀細胞貧血：MALDI-TOF-MS技術不僅在惡性血液系統疾病診斷、預后判斷發揮作用，在其他血液系統疾病中也有深入研究應用。鐮狀細胞貧血（SCDs）屬于遺傳性血紅蛋白病之一，新生兒血紅蛋白病的篩查通常是利用敏感的電泳和等電聚焦電泳技術來確定異常的血紅蛋白。目前該類疾病的常規新生兒篩查受科技及經濟局限在多數國家并未執行，經常優選的方法是種族靶向新生兒篩查，不利于大面積擴展。Hachani J等[13]應用MALDI-TOF-MS技術對844例Guthrie卡上的新生兒干燥血凝塊樣本進行了回顧性研究，并從每1例干血斑樣本中檢測的1000個質譜中選取4個差異蛋白進行鑒定，結果以MALDI-TOF-MS為基礎的篩查方法與傳統方法相比結果具有高度相關性，支持MALDI-MS技術可作為通用的篩查方法對SCDs新生兒進行篩查，具有高通量、經濟、高敏感性及能夠自動區分鐮狀血紅蛋白等特點。

討 論

2001年開始的蛋白質組學研究開創了后基因組研究的新時代。血液蛋白質組學研究是當前蛋白質組學研究重點領域之一。以MALDI-TOF-MS技術為主要手段的蛋白質組學技術已經越來越多地應用于血液系統疾病的研究中，其具有準確性高、穩定性好、靈敏度高、重復性好、高通量等特點，不但可以用于惡性血液病的診斷、發病機制、療效及預后判斷方面的研究，在良惡性血液疾病鑒別診斷方面也將發揮重大作用。未來隨著新的質譜儀的出現，蛋白質譜技術在蛋白質組學研究中必將發揮越來越大的作用。

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