香豆素類熒光底物的合成及其在微生物檢測中的應用進展

吳清平，馬延霞，2，3，張菊梅，韋獻虎，2，3

（1廣東省微生物研究所，省部共建華南應用微生物國家重點實驗室，廣東省菌種保藏與應用重點實驗室，廣東省微生物應用新技術公共實驗室，廣東 廣州 510070；2中國科學院廣州化學研究所，廣東 廣州 510650；3中國科學院大學，北京 100049）

香豆素類熒光底物的合成及其在微生物檢測中的應用進展

吳清平1，馬延霞1，2，3，張菊梅1，韋獻虎1，2，3

（1廣東省微生物研究所，省部共建華南應用微生物國家重點實驗室，廣東省菌種保藏與應用重點實驗室，廣東省微生物應用新技術公共實驗室，廣東 廣州 510070；2中國科學院廣州化學研究所，廣東 廣州 510650；3中國科學院大學，北京 100049）

香豆素類熒光底物主要是由作為熒光團的羥基香豆素和7-氨基-4-甲基香豆素或者它們的取代物的各類衍生物，包括糖苷類、羧酸酯類、磷酸酯類、肽類等。本文介紹了這些底物的合成方法。熒光團一般通過Pechmann縮合法合成，然后再與乙酰溴代糖、酰氯、亞磷酸酯、叔丁氧基保護的氨基酸等縮合生成相應的熒光底物，像4-甲基傘形酮基-β-D-吡喃半乳糖苷、4-甲基傘形酮辛酸酯和L-丙氨酰-7-氨基-4-甲基傘形酮等。將熒光底物加入到培養基中，可以實現對微生物的快速檢測。熒光底物應用于微生物檢測的依據是特異性酶反應，不同的熒光底物對應的酶和所檢測的微生物不同。當單一底物不能有效檢測和鑒定目標微生物時，采用復合底物能明顯提高檢測效果。此外，本文還指出了現有熒光底物存在的缺點，并對未來發展進行了展望。

熒光底物；4-甲基傘形酮；7-氨基-4-甲基香豆素；微生物檢測

近年來，食品安全問題受到人們的日益關注，已經在全世界范圍內引起高度重視。而食源性致病菌是引起食源性疾病的重要原因，是食品安全的重大隱患[1]。近年來由食源性致病菌引發的疾病呈上升趨勢。如大腸桿菌O157：H7引起了近萬人中毒[2]。因此對致病菌進行快速有效的檢測就顯得尤為重要。傳統的檢測方法（如分離培養、生化鑒定等）對致病菌的檢測特異性不高、靈敏度低、操作繁瑣耗時，不能實現快速檢測。近年來，特異性酶底物合成和應用發展迅速，已經廣泛應用于微生物檢測。該方法是將熒光底物或顯色底物加入到培養基中，微生物代謝過程中產生的特異性酶將底物分解，釋放出色原（直接顯色）或熒光團（需在紫外燈下照射顯色），從而實現對微生物的檢測和鑒定[3]。盡管特異性顯色酶底物法具有操作簡便、靈敏性高、特異性好、檢測時間短等優點，但是要將該方法作為日常檢測方法成本較高，主要是因為現有熒光底物和顯色底物的合成工藝復雜、產率低、價格昂貴。因此迫切需要開發出簡單易行的合成工藝，降低酶底物的生產成本。近年來通過對常見食源性致病菌顯色培養基及其顯色底物進行深入研究，目前已成功制備出顯色底物磷脂酰基醇（PI）用于檢測單核細胞增生性李斯特菌[4]，與進口產品效果相當，明顯降低了檢測成本。

目前國內外應用的熒光底物主要是4-甲基傘形酮和7-氨基-4-甲基香豆素的各類衍生物，包括糖苷類、酯（脂）類、肽類等。4-甲基傘形酮主要用于檢測酯（脂）水解酶、糖苷酶等，7-氨基-4-甲基香豆素用與檢測肽酶或蛋白酶。本文歸納和總結了熒光底物的研究進展，以為它們的合成提供參考。

1 4-甲基傘形酮和7-氨基-4-基香豆素的合成

1.1 4-甲基傘形酮的合成

合成4-甲基傘形酮的方法主要有Perkin法、Konevenagal法、Reformatsky法、Wittig法及Pechmann法等方法[5]。其中因Pechmann法合成4-甲基傘形酮所用的原料間苯二酚和乙酰乙酸乙酯便宜易得，且產率高，因此最常被用來合成4-甲基傘形酮。Pechmann反應制備4-甲基傘形酮影響產率的一個重要因素是反應中使用的催化劑。傳統的催化劑像濃硫酸等液體酸催化劑存在許多不足，如反應時間長，催化劑大大過量且不能回收循環使用，反應產生的廢酸污染環境，催化劑腐蝕設備等。為此，國內外研究者不斷研究和探索了多種新型催化劑。一些路易斯酸性的鹽類像TiCl4[6]等，催化劑用量少，反應時間短，產率高，但是不能回收重復利用，且所含金屬元素一般是稀有金屬元素，價格昂貴。無機鹽NaHSO4·H2O[7]催化合成4-甲基傘形酮用量少，且便宜易得，但是不能回收利用。利用[Bmim]PF6、[Bmim]BF4[8]等離子液體為溶劑兼催化劑合成4-甲基傘形酮產率高達95%，且離子液體可以回收重復利用而產率沒有明顯的下降。雜多酸像磷鎢酸[9]、H4SiW12O42·15H2O[10]等催化Pechmann縮合反應，反應無溶劑，后處理簡單，符合綠色化學的要求。4-甲基傘形酮合成路線見圖1。

圖1 4-甲基傘形酮的合成

1.2 7-氨基-4-甲基香豆素的合成

7-氨基-4-甲基香豆素（簡稱香豆素-120）是重要的熒光物質。因為7位的氨基存在，易與肽鏈末端羧基縮合形成多肽-香豆素類熒光底物，已成功地應用于微生物檢測、免疫檢測、生化酶學和多肽合成等研究領域。有關7-氨基-4-甲基香豆素合成的報道不是很多。傳統的合成7-氨基-4-甲基香豆素的方法就是以間氨基苯酚和乙酰乙酸乙酯為原料在濃硫酸催化下經Pechmann縮合反應制得[11]。利用微波輔助技術graphite∶K10（2∶1）[12]為催化劑直接由間氨基苯酚和乙酰乙酸乙酯出發合成7-氨基-4-甲基香豆素。相對于傳統的合成方法，此方法避免了使用濃硫酸，經濟環保，可行性高。7-氨基-4-甲基香豆素的合成路線見圖2。

圖2 7-氨基-4-甲基香豆素的合成

2 香豆素類熒光底物的合成

酶底物可以是糖苷、肽類、酯（脂）類、核苷酸等。目前已經開發出來的香豆素類熒光底物包括糖苷類、羧酸酯類、磷酸酯類、硫酸酯類、肽類等。這些底物中，糖苷類熒光底物的研究和應用最多、最廣泛。

2.1 糖苷類熒光底物的合成

糖苷類化合物的合成方法很多，如Koenigs-Knorr法、相轉移催化法、酰鹵法、三氯乙酰亞氨酯（Schmidt）法、鹵代乙酸酯法、硫苷法以及酶促法等。文獻報道的香豆素類糖苷化的糖基供體一般是全乙酰的溴代糖，所用方法主要是Koenigs-Knorr 法[13]。Koenigs-Knorr法是最早發現的糖苷化反應之一，在銀鹽或汞鹽的催化下，全乙酰溴代糖作為糖基供體和受體發生糖苷化反應。該反應產率不高，且全乙酰溴代糖不穩定，采用的重金屬促進劑會產生大量對環境不友好的廢液。三氯乙酰亞胺酯作為糖基供體時，反應是由BF3·Et2O催化的[14]。BF3·EtO2催化糖苷化反應時，避免了使用不穩定的溴代糖，反應產率相對較高，但是該反應需要在嚴格無水的條件下進行。4-甲基傘形酮酰-β-D-葡糖苷酸還可以由4-甲基傘形酮酰-β-D-葡萄糖苷氧化得到[15]。相對于Koenigs-Knorr法，這種方法總產率明顯要高。幾種糖苷類熒光底物常用的合成方法見圖3、圖4和圖5。

圖3 7,8-二羥基-4-甲基香豆素-β-D-葡萄糖苷的合成

圖4 4-甲基傘形酮基-α-D-甘露糖苷的合成

2.2 羧酸酯（脂）類熒光底物的合成

羧酸酯類熒光底物是由香豆素類和酸酐、酰氯在吡啶中反應制得[16]。乙酸酯和丁酸酯的產率和純度都很高。香豆素類羧酸酯（脂）的合成路線見圖6。

圖6 香豆素類羧酸酯（脂）的合成

2.3 磷酸酯酶類熒光底物的合成

磷酸酯酶類熒光底物主要是由三氯氧磷法合成。香豆素類和三氯氧磷在0℃，吡啶的溶液中反應[16]，直接得到磷酸單酯，方法簡單。但是后處理提取產物時必須嚴格控制pH值為6，產物以吡啶鹽的形式被提取出來，粗產率比較高，后處理過程中會損失掉相當一部分產物。最終產率不足45%。 Kumar等[17]用亞磷酸酯法合成了香豆素的磷酸酯。這種方法具有反應溫和、反應副產物少等諸多優點。圖7為磷酸酯酶類熒光底物的合成路線。R為苯基、羧基、苯并唑基等。圖8為4-甲基傘形酮磷酸酯的合成路線圖。

圖7 磷酸酯酶類熒光底物的合成

圖8 4-甲基傘形酮磷酸酯的合成

2.4 硫酸酯酶類熒光底物的合成

硫酸酯酶類熒光底物由香豆素類和氯磺酸在吡啶中反應生成[16]。通過吡啶鹽分離產物，產率和純度都比通過堿金屬鹽分離要好很多。圖9為硫酸酯酶類熒光底物的合成方法，其中R=2-苯并噁唑基、苯并噻唑基或苯基。

圖9 硫酸酯酶類熒光底物的合成

2.5 肽類熒光底物的合成

肽類熒光底物由7-氨基-4-甲基香豆素和芐氧羰基保護的氨基酸縮合而成[18]。芐氧羰基保護的氨基酸和7-氨基-4-甲基香豆素溶于二氯甲烷中，0～5℃攪拌下加入二環己基碳二亞胺（DCC）和4-N,N二甲基吡啶，室溫下攪拌反應24h得到芐氧羰基保護的底物。脫保護基芐氧羰基常用的方法是三氟乙酸法和鹽酸法。圖10為肽類熒光底物的合成路線。

圖10 氨肽酶類熒光底物的合成

3 香豆素類熒光底物在微生物檢測中的應用

熒光底物應用于微生物檢測的原理是微生物代謝過程中產生的特異性酶可以分解熒光底物，釋放出熒光團，紫外燈下照射（4-甲基傘形酮的激發波長365nm，發射波長440nm；7-氨基-4-甲基香豆素的激發波長370nm，發射波長440nm）會發出熒光，顯示一定的顏色。如果培養基中含有目標微生物，就會將熒光底物分解，從而在紫外燈下照射時，培養基會顯示特定顏色的熒光（4-甲基傘形酮發藍色熒光），從而可以確定目標菌的存在。國外關于熒光底物應用于微生物檢測的研究和報道已經很多。如Berg等[19]用4-甲基傘形酮-β-D-半乳糖苷、4-甲基傘形酮-庚酸酯和4-甲基傘形酮-葡糖酸苷檢測了飲用水中的總大腸菌群數。將4-甲基傘形酮-β-D-半乳糖苷加入到瓊脂培養基中再結合膜過濾技術，在6h內對大腸菌群的檢出限度可達1CFU/100mL。香豆素類熒光底物所對應的的酶及其所檢測的目標微生物見表1。

有時一種單一的熒光底物并不能準確的檢測和鑒定某種微生物，這時結合另外一種技術或將熒光底物和顯色底物結合起來使用就會達到理想的效果。4-甲基傘形酮基-辛酸酯檢測沙門氏菌時靈敏度高、速度快、易操作，但是特異性不是很高，常會出現假陽性結果。而假陽性結果中的絕大多數有氧化酶活性的，所以Freydiere等[32]、Mannafi等[33]將4-甲基傘形酮基-辛酸酯和氧化酶測試結合起來檢測沙門氏菌，所得到的結果更加準確、可信。Mannafi等[34]將熒光底物L-焦谷氨酰-7-羥基-4-甲基傘形酮和顯色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃葡萄糖苷結合起來使用可以區分腸球菌和化膿性鏈球菌。腸球菌能夠分解這兩種底物，而化膿性鏈球菌只能分解L-焦谷氨酰-7-羥基-4-甲基傘形酮，因而可以它們區分開來。

4 結 語

表1 常見的一些香豆素類熒光底物及其檢測的目標微生物

熒光底物因其靈敏度高、檢測速度快等優點已廣泛應用于微生物檢測工作中。但是香豆素類熒光底物也有其自身的缺點：對pH值有依賴性、固體培養基中易擴散、有些不穩定且不溶于水，這些缺點限制了其在微生物檢測中的應用[35]。因此，新熒光底物的開發顯得尤為重要。Markaryan和Voznyi[36]合成了3-氰基-4-三氟甲基香豆素基-β-D-吡喃半乳糖苷，并應用于β-D-半乳糖苷酶的測試，發現3-氰基-4-三氟甲基香豆素的pKa比4-甲基傘形酮要低，更適合于低pH值環境中的檢測。Chilvers 等[37]合成了7-羥基-3-甲酸乙酯香豆素-β-D-吡喃半乳糖苷。pH=6時，7-羥基-3-甲酸乙酯香豆素的熒光強度比4-甲基傘形酮的高5倍以上，而且毒性更低，檢測速度也更快。

關于熒光底物的合成和在微生物方面的應用，國外已經發展的比較成熟，且已經有商品化的培養基，但是我國關于這方面的文獻報道卻很少。近年來國內所需熒光底物大多需要依賴進口，價格十分昂貴，嚴重制約著我國在利用顯色培養基技術檢測微生物方面的發展。因此，急需開發出我國簡單易行的合成工藝，降低熒光底物的生產成本，促進熒光底物應用于微生物檢測技術的發展。與此同時，還應該開發出更加優化的熒光底物，豐富熒光底物的種類。目前已成功研制出4-甲基傘形酮-β-D-吡喃半乳糖苷的實驗室合成工藝，為進一步合成其他熒光底物打下了良好基礎。

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Progress in syntheses of coumarin fluorogenic substrates and their application in microbial detections

WU Qingping1，MA Yanxia1，2，3，ZHANG Jumei1，WEI Xianhu1，2，3
（1Guangdong Institute of Microbiology，South China State Key Laboratory of Applied Microbiology，（Ministry-Province Jointly Developed），Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application，Guangdong Open Laboratory of Applied Microbiology，Guangzhou 510070，Guangdong，China ；2Guangzhou Institute of Chemistry，Chinese Academy of Sciences，Guangzhou 510650，Guangdong，China；3University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China）

Coumarin fluorogenic substrates are mainly derivatives of fluorophore，such as hydroxycoumarin and 7-amino-4-methyl coumarin or their substitution，including glycosides，carboxylic esters，phosphate，peptides and the like. This review introduces the synthesis of these substrates. Fluorophores are generally synthesized by Pechmann condensation，then their condensation with acetyl bromide sugar，acyl chloride，phosphite ester andtert-butoxy-protected amino acids generate the corresponding fluorogenic substrate，like 4-methylum belli feryl-β-D-galactopyranoside，4-methylumbelliferyl caprylate，L-alanyl-7-amino-4-methylumbelliferone and the like. The fluorescent substrates are added to the media to achieve rapid detection of microorganisms.The application of fluorogenic substrates in microbiological testing is based on specific enzyme reactions. Different fluorescent enzyme substrates correspond to different enzymes which target different microorganisms.When a single substrate can not effectively detect and identify the target microorganisms，the composite substrates can be used to improve the detection results. In addition，problems of the existing fluorogenic substrate in microbial detection are pointed out，and future directions are discussed.

fluorogenic substrates；methylumbelliferone；7-amino-4-methylcoumarin；microbiological detection

TQ 206

A

1000-6613（2014）09-2444-07

10.3969/j.issn.1000-6613.2014.09.035

2014-01-03；修改稿日期：2014-01-20。

廣東省科技計劃（2011A011303001）及廣東省自然科學基金研究團隊項目（S2012030006235）。

及聯系人：吳清平（1962—），男，研究員，博士，研究方向食品微生物安全監測與控制技術研究。E-mail wuqp203@163.com。