婦科止帶片微生物限度檢查的方法學驗證研究

楊春杰，丁連峰，馬 凱，劉超祥

（1.安徽濟人藥業有限公司；2.亳州職業技術學院，安徽 亳州 236800）

婦科止帶片微生物限度檢查的方法學驗證研究

楊春杰1，丁連峰1，馬 凱1，劉超祥2

（1.安徽濟人藥業有限公司；2.亳州職業技術學院，安徽 亳州 236800）

目的 建立婦科止帶片微生物限度檢查方法。方法 采用薄膜過濾法進行細菌數計數，采用平皿法進行霉菌和酵母菌計數，采用常規法進行控制菌的檢查。結果 大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉菌回收率皆在 80%以上；金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌回收率皆在95%以上；陰性菌對照組均無生長。結論 該法可以作為婦科止帶片的微生物限度檢查方法。

婦科止帶片；微生物限度檢查法；薄膜過濾法；平皿法；方法學驗證

婦科止帶片具有清熱燥濕、收斂止帶，用于慢性子宮頸炎、子宮內膜炎、陰道黏膜炎等引起的濕熱型赤白帶癥。該片劑具有中等抗菌活性，使微生物限度檢查結果不準確，給臨床使用帶來隱患；為保證微生物限度檢查方法及結果的有效性，對具有抗菌活性的藥品進行微生物限度檢查，應首先消除其抗菌活性，并通過實驗驗證抗菌活性去除效果［1-2］。本實驗在對婦科止帶片進行微生物限度檢查時采用薄膜過濾的方法，建立對婦科止帶片的微生物限度檢查方法，該方法可有效地消除婦科止帶片的抑菌作用。

1 儀器與材料

儀器：YJA型均漿儀（臺州市椒江五星試壓設備有限公司），NS01-75D4型專用濾膜（孔徑：0.45 μm），NS01-D7型雙聯導液管套裝及 NS01-D5型可重復消毒薄膜過濾器，SPX-150B生化培養箱（上海博迅實業有限公司），MJX-160B霉菌培養箱（上海博迅實業有限公司），HPX-9082MBE電熱恒溫培養箱（上海博迅實業有限公司），AR5120電子分析天平（奧豪斯國際貿易有限公司）。

樣品：婦科止帶片（規格：每片0.36 g，安徽濟人藥業有限公司）。

培養基：玫瑰紅鈉瓊脂培養基（批號1210183）、營養瓊脂培養基（批號 130118）、營養肉湯培養基（批號121022）、改良馬丁瓊脂培養基 （批號010520）、膽鹽乳糖培養基（批號1301173）、麥康凱瓊脂培養基（批號130304）、4-甲基傘形酮葡糖苷酸（批號121022）、膽鹽硫乳瓊脂培養基 （批號130129）、四硫磺酸鈉亮綠培養基（批號1301242）、三糖鐵瓊脂培養基（批號121022）。以上培養基均由北京三藥科技開發公司生產，靈敏度實驗符合《中國藥典》2010年版規定，配制后的pH需符合規定，若不相符需進行調整［3-4］。試劑：無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液（pH＝7.0，北京三藥科技開發公司生產），氯化鈉（分析純，上海市申翔化學試劑有限公司生產），聚山梨酯80（上海市申宇醫藥化工有限公司生產）。

菌種：大腸埃希菌（Escherichia coli）［CMCC （B）44 102］、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）［CMCC（B）26 003］、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）［CMCC（B）63 501］、白色念珠菌（Candida albicans）［CMCC（F）98 001］、黑曲霉（Aspergillus niger）［CMCC（F）98 003］、乙型副傷寒沙門菌（Salmonella paratyphi B）［CMCC（B）50094］（中國食品藥品檢定研究院）。

2 方法與結果

參照《中國藥典》2010版微生物限度檢查法實驗［5］。

2.1 菌液制備

2.1.1 細菌菌液的制備 接種金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基中，經30～35℃培養18～24 h。接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基中，23～28℃培養 24～48 h。上述培養物用質量分數為0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋10倍，白色念珠菌至 10-5、黑曲霉菌至 10-4、金黃色葡萄球菌至 10-7、大腸埃希菌至 10-7、枯草芽孢桿菌至10-5和乙型副傷寒沙門菌至 10-8。制成每 1 mL含菌數約為50～100 cfu（菌落形成單位）的菌懸液，備用，菌落計數結果見表1。

表 1 試驗用菌檢查（菌落計數平均值，cfu·mL-1）

2.1.2 真菌菌液的制備 接種黑曲霉菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基中，23～28℃培養5～7 d，加3～5 mL含0.05%（v／v）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將黑曲霉孢子洗脫，吸出孢子至無菌試管內，用含0.05% （v／v）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋，用標準比濁管比濁，其濁度與標準比濁管相當后，取1 mL稀釋后的孢子懸液，用0.05% （v／v）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋至10-4，制成每1 mL含菌數約為50～100 cfu的菌懸液，備用。上述各株菌的培養物均為第三代的培養物。

2.2 菌液檢驗

2.2.1 細菌菌液的檢驗 取上述金黃色葡萄球菌至10-7、枯草芽孢桿菌至10-5、大腸埃希菌至 10-7、乙型副傷寒沙門菌至10-8的稀釋液各1 mL，分別用45℃營養瓊脂培養基 20 mL注皿，各平行測定兩皿。30～35℃培養48 h，計數，應約為50～100 cfu·mL-1。

2.2.2 真菌菌液的檢驗 取上述白色念珠菌至10-5的稀釋液及上述黑曲霉菌至 10-4孢子懸液各 1 mL，分別用45℃玫瑰紅鈉瓊脂培養基20 mL注皿，各平行測定兩皿，23～28℃培養，逐日觀察計數，應約為50～100 cfu·mL-1。

2.3 細菌、霉菌及酵母菌計數方法的驗證 供試液制備：取供試品 10 g置無菌的勻漿罐中，加入45℃無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液（pH＝7.0）至 100 mL，勻漿2 min（3 000 r·min-1），制成質量濃度為100 g·L-1的供試液。

（1）平皿法：試驗組：取供試液1 mL加入平皿后，加入上述相應的 50～100 cfu·mL-1的試驗菌 1 mL，然后每皿注入20 mL營養瓊脂培養基或玫瑰紅鈉瓊脂培養基，搖勻，在規定溫度培養，觀察結果。

菌液組：取上述50～100 cfu·mL-1的試驗菌各1 mL，然后每皿注入20 mL營養瓊脂

培養基或玫瑰紅鈉瓊脂培養基，搖勻，在規定溫度培養，觀察結果。

供試品對照組：取供試液1 mL加入平皿后，然后每皿注入 20 mL營養瓊脂培養基或玫瑰紅鈉瓊脂培養基，搖勻，在規定溫度培養，觀察結果。按如下公式計算試驗組的加菌回收率（公式1）：

加菌回收率%＝（試驗組菌落數均值 -供試品對照組菌落數均值）／菌液組菌落數均值 ×100%。

（2）培養基稀釋法：試驗組：取供試液分別按每皿0.5 mL、每皿0.2 mL加入平皿后，加入上述相應的50～100 cfu·mL-1的試驗菌菌液 1 mL，然后每皿注入20 mL營養瓊脂培養基或玫瑰紅鈉瓊脂培養基，搖勻，在規定溫度培養，觀察結果。

菌液組：同平皿法。

供試品對照組：除不加菌液外，同試驗組測定方法，置規定溫度培養，觀察結果。按公式1計算試驗組的加菌回收率。

（3）薄膜過濾法：試驗組：取供試液10 mL以500 r·min-1離心5 min后，取上清液 1 mL加入薄膜過濾器（濾膜先用水沖洗液潤濕）中，用500 mL無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液 （pH＝7.0）沖洗，每次100 mL，在最后一次沖洗液中加入上述相應的50～100 cfu·mL-1的試驗菌 1 mL，沖洗完畢后，濾干，取出濾膜貼于營養瓊脂培養基或玫瑰紅鈉瓊脂培養基上，置規定溫度培養，觀察結果。

菌液組：除不加供試液外，同試驗組操作，置規定溫度培養，觀察結果。

供試品對照組：除不加菌液外，同試驗組操作，置規定溫度培養，觀察結果。

按公式1計算試驗組的加菌回收率。

2.4 控制菌檢查方法的驗證

2.4.1 大腸埃希菌：按常規法 試驗組：取質量濃度為100 g·L-1供試液10 mL加入100 mL膽鹽乳糖培養基中，加入上述50～100 cfu·mL-1的大腸埃希菌菌液1 mL，置30～35℃培養18～24 h，按相應的控制菌的檢查法檢查。

陰性對照組：取稀釋液 10 mL加入 100 mL膽鹽乳糖培養基中，置30～35℃培養18～24 h，按相應的控制菌的檢查法檢查。

陽性對照組：取上述50～100 cfu·mL-1的大腸埃希菌菌液1 mL加入100 mL膽鹽乳糖培養基中，置30～35℃培養18～24 h，按相應的控制菌的檢查法檢查。

供試品組：取質量濃度為100 g·L-1供試液供試液10 mL加入100 mL膽鹽乳糖培養基中，置30～35℃培養18～24 h，按相應的控制菌的檢查法檢查。

陰性菌對照組：陰性對照菌采用金黃色葡萄球菌，方法同試驗組，陰性對照菌不得檢出。

2.4.2 沙門菌：按常規法 試驗組：取供試品10 g，加入200 mL的營養肉湯培養基中，混勻，加入上述50～100 cfu·mL-1的乙型副傷寒沙門菌菌液1 mL，置30～35℃培養18～24 h，按相應的控制菌的檢查法檢查。

陰性對照組：取200 mL的營養肉湯培養基，置30～35℃培養 18～24 h，按相應的控制菌的檢查法檢查。

陽性對照組：取上述50～100 cfu·mL-1的乙型副傷寒沙門菌菌液 1 mL，置 30～35℃培養 18～24 h，按相應的控制菌的檢查法檢查。

供試品組：取供試品 10 g加入 200 mL的營養肉湯培養基中，置 30～35℃培養 18～24 h，按相應的控制菌的檢查法檢查。

陰性菌對照組：陰性菌對照組采用金黃色葡萄球菌，方法同試驗組，陰性對照菌不得檢出；實驗結果見表2。

表2 不同菌種計數方法的驗證（cfu）

表3 控制菌檢查方法的驗證結果

3 討論

在細菌、霉菌和酵母菌數檢查的方法驗證試驗中，平皿法對大腸埃希菌、白色念球菌、黑曲霉菌的回收率均高于80%；采用平皿法及培養基稀釋法每皿0.2 mL、每皿0.5 mL對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的回收率不能達到 70%，采用薄膜過濾法對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的回收率高于95%。結合細菌、霉菌和酵母菌的驗證實驗結果，當采用薄膜過濾法時能滿足細菌檢查的基本要求，采用平皿法時能滿足霉菌和酵母菌檢查的基本要求。

實驗時稀釋液及培養基的溫度對實驗結果存在影響，應使稀釋液及培養基溫度約在45℃。溫度過低不能充分溶解樣品及稀釋，溫度過高容易殺害實驗中驗證用菌，均影響檢驗結果［6］。

實驗中加入相應菌液的意義在于明確采用的實驗方法是否可以將藥品抑菌作用消除，如果加入菌液生長良好，則說明供試品在該檢驗條件下無抑菌作用或抑菌作用基本可以忽略不計，可以照此實驗條件繼續進行驗證。如果相應菌株生長微弱、緩慢或不生長，則說明此試驗條件不能完全除去藥品的抑菌作用，不能照此實驗條件繼續進行驗證，應進行進一步調整以達到完全去除供試品抑菌作用［7］。

從表3可以看出陰性菌對照組中陰性菌未檢出，控制菌大腸埃希菌和沙門菌的檢查可采用常規法。

綜合分析，婦科止帶片微生物限度檢查標準如下：取本品10 g，加無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液（pH ＝7.0）至100 mL，制成質量濃度為 100 g·L-1的供試液。取該供試液 10 mL以 500 r·min-1離心5 min后，取上清液1 mL采用薄膜過濾法以每次100 mL沖洗總量為400mL的無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液 （pH＝7.0），濾干后取膜貼于營養瓊脂培養基上培養進行細菌數測定；取質量濃度為 100 g·L-1的供試液1 mL用平皿法進行霉菌和酵母菌計數；取質量濃度為100 g·L-1的供試液 10mL按常規法進行大腸埃希菌的檢查，取供試品10 g按常規法進行沙門菌的檢查。

［1］ 潘友文.現代醫藥工業微生物實驗室質量管理與驗證技術［M］.北京：中國協和醫科大學出版社，2004：179-185.

［2］ 楊 靜.藥品微生物限度檢查法的影響因素分析［J］.中國藥事，2008，22（12）：133-135.

［3］ 馬緒榮，蘇德模.藥品微生物學檢驗手冊［M］.北京：科學出版社，2001：403-413.

［4］ 紀紹梅，嚴德喜.微生物培養基質控與圖解［M］.北京：北京科學技術出版社，2006：18-23.

［5］ 國家藥典委員會.中國藥典：一部［S］.北京：中國醫藥科技出版社，2010：79-88.

［6］ 李云龍.中國藥品檢驗標準操作規范［S］.北京：中國醫藥科技出版社，2010：354-355.

［7］ 劉 鵬，馬仕洪.普盧利沙星薄膜衣片微生物限度檢查法的建立［J］.中國藥事，2013，27（4）：413-415.

Methodological validation method for microbial limit test of fukezhidai tablets

YANG Chun-jie，DING Lian-feng，MA Kai，et al
（Anhui Jiren Pharmaceutical Industries Co.，Ltd，Bozhou，Anhui 236800，China）

Objective To establish a microbial limit test for fukezhidai tablets.Methods We used membrane filtration method for bacterium，plate method for fungus and yeast test，conventional test method for control bacteria examination.Results The recovery rates of Escherichia coli，Candida albicans and Aspergillus niger were all more than 80%and more than 95%for Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis.Negative control group had no growth.Conclusions The method can be used to examine microbial limit of fukezhidai tablets.

fukezhidai tablets；microbial limit test；membrane filtration method；plate method；methodological validation

10.3969／j.issn.1009-6469.2014.03.015

2013-08-25，

2013-12-23）

楊春杰，男，副研究員，研究方向：中藥制劑，E-mail：yangchunjie8＠126.com