TNF-α預測高血壓大鼠發生腦卒中的實驗研究

劉淑云，張 平，林仁勇，張 爽，聶亞雄

（1.廣東省深圳市觀瀾人民醫院神經內科，廣東 深圳 518110；2.南華大學附屬南華醫院神經內科，湖南 衡陽 421002；3.南華大學附屬第一醫院神經內科，湖南 衡陽 421001）

TNF-α預測高血壓大鼠發生腦卒中的實驗研究

劉淑云1，張 平2，林仁勇1，張 爽1，聶亞雄3

（1.廣東省深圳市觀瀾人民醫院神經內科，廣東 深圳 518110；2.南華大學附屬南華醫院神經內科，湖南 衡陽 421002；3.南華大學附屬第一醫院神經內科，湖南 衡陽 421001）

目的 觀察易卒中型腎血管性高血壓大鼠（RHRSP）在經歷人工寒潮卒中前血漿 TNF-α含量差異，從而探討 TNF-α能否預測高血壓大鼠發生腦卒中。方法 雙腎雙夾法制作RHRSP模型，經歷人工寒潮并于寒潮前取血，酶聯免疫吸附測定法檢測血漿 TNF-α含量。結果 腦梗死組和腦出血組寒潮前 TNF-α含量明顯高于非卒中組，高血壓各組血壓與 TNF-α成正相關。結論 TNF-α有可能成為預測卒中的分子標志物之一。

腦卒中；易卒中腎血管性高血壓大鼠；腫瘤壞死因子；人工寒潮

腦卒中已上升為我國第一位致死致殘性疾病。臨床上，腦卒中多發生于某些特定人群如高血壓、糖尿病患者，但這些具有高危因素的人群，也不是都發生卒中。高血壓是腦卒中最重要的獨立危險因素，腦卒中發病率、死亡率與血壓升高有著十分密切的關系［1-2］。如果能在高血壓患者中篩查出易促發卒中的高危人群，并進行及時、有效的干預，無疑是預防腦卒中發作的最佳途徑。

目前對高血壓患者發生卒中并無足夠的預警手段。本研究采用易卒中型腎血管性高血壓大鼠（RHRSP）模型，人工模擬自然寒潮誘導高血壓大鼠自發腦卒中，通過檢測 RHRSP在經歷寒潮后的卒中組與非卒中組寒潮前血清 TNF-α含量差異，初步探討人工寒潮對 RHRSP發生卒中的影響及通過血清中TNF-α的表達差異來預測RHRSP發生卒中的情況。旨在為臨床上高血壓患者將來易發生相關性腦血管疾病篩選出有效、簡便的預測指標，為個體化防治提供“風向標”。

1 材料和方法

1.1 高血壓大鼠模型制備 健康雄性 SD大鼠230只（南華大學實驗動物部提供），體重80～120 g，鼠齡 60～90 d。200只按既定的雙腎雙夾法［3］制成RHRSP模型，用“Ω”環形銀夾，銀絲直徑為0.5 mm，環的內徑為0.3 mm。術后常規用慶大霉素8 000 U·kg-1腹腔內注射預防感染，術后4～6 h恢復喂食，以顆粒型普通大鼠飼料喂養，飲用自來水，動物房溫度控制在20℃左右，光照周期12 h，模擬正常晝夜節律。用鼠尾測壓儀（HX-1型），37℃恒溫箱預熱15 min后，經尾動脈測定收縮壓，每只大鼠測3次，取平均值作為該大鼠的血壓值。腎動脈狹窄術前測量1次，術后每周測量1次，選取術后12周高血壓形成穩定的大鼠進行實驗。假手術組30只，造模方法同高血壓模型組，但不縮窄腎動脈。

1.2 模擬人工寒潮 人工寒潮前按 Zealonga 5分制評分標準，對大鼠進行神經學評分：0分，無神經損傷癥狀；1分，不能完全伸展對側前爪；2分，向外側轉圈；3分，向對側傾倒；4分，不能自發行走，意識喪失。人工寒潮前剔除 longa≥1的大鼠，將上述大鼠置于RXZ2300A型智能人工氣候箱（寧波江南儀器廠）中，調節相對濕度70%，溫度22℃12 h，4℃ 12 h為1 d循環，共3 d。每只大鼠寒潮前舌下靜脈取血約1 mL，離心10 min（3 000 r·min-1）分離血漿，分裝后 -80℃冰箱保存備用。

1.3 TNF-α含量測定 采用雙抗體夾心ELISA法測定TNF-α，酶標儀450 nm處測定OD值，curve-expert 1.3軟件作標準曲線，輸入各OD值，計算出TNF-α含量。

1.4 大鼠腦組織病理學檢查 寒潮結束，將大鼠用 10%水合氯醛（300 mg·kg-1）麻醉，經左心室向升主動脈插管，剪開下腔靜脈，同時快速灌注肝素化生理鹽水（50 U·mL-1），120 mL（滴速為10 mL ·min-1）以清除血管內血液，斷頭取腦，-20℃冷凍10 min后將腦切成2 mm厚的冠狀薄片，先肉眼觀察腦組織有無異常，然后將大鼠腦組織固定于4%的多聚甲醛溶液中 8 h，石臘包埋，連續石蠟切片，切片厚度 5 μm，HE染色，XDS-1B普通顯微鏡觀察腦卒中情況。根據寒潮后鏡檢結果把RHRSP組分為非卒中組，腦梗死組，腦出血組。見圖 1～3。

圖1 大鼠腦組織肉眼觀察注：RHRSP易卒中型腎血管性高血壓大鼠。A：RHSP組腦出血，白色箭頭所示為腦出血病灶；B：RHRSP組腦梗死，白色箭頭所示為腦梗死病灶，C：假手術組。

圖2 大鼠腦組織光鏡觀察（HE×100）注：RHRSP易卒中型腎血管高血壓大鼠。A：RHRSP組腦出血病灶；B：RHRSP組難梗死病灶。

圖3 腦小動脈形態（HE）注：RHRSP：易卒中型腎血管性高血壓大鼠。A：RHRSP組，黑色箭頭示腦內動脈管壁增厚，管腔狹窄；B：假手術組，黑色箭頭示正常腦小動脈。

1.5 數據處理和統計分析 應用 SPSS 11.0軟件包進行統計學分析，數據用均數±標準差（±s）表示，均為正態資料，寒潮前兩組間比較采用t檢驗；寒潮前血壓與 TNF-α水平的的關系采用直線相關分析。

2 結果

2.1 卒中情況 術后RHRSP組因腹部大出血死亡1只，因感染死亡2只，寒潮前 longa≥1的剔除3只，最后經歷寒潮的為假手術組30只，RHRSP組為194只。其中假手術組經歷寒潮后沒有出現腦卒中；RHRSP組有13只發生腦梗死，有 35只發生腦出血，其卒中率為 24.7%，與以往實驗研究［5］基本一致。

2.2 各組大鼠寒潮前血壓與血漿 TNF-α含量的比較 寒潮前手術組血壓高于假手術組血壓，有顯著性差異（P＜0.001），且卒中組（包括腦出血組和腦梗死組）高于非卒中組（P＜0.001或 P＜0.05）（見圖4）。寒潮前手術組 TNF-α含量高于假手術組，有顯著性差異（P＜0.001），且卒中組高于非卒中組（P＜0.001），腦出血組TNF-α含量高于腦梗死組，但無顯著性差異。具體見表1。

圖4 寒潮前各組血壓折線圖注：大鼠數值（非卒中組將血壓一致的所有大鼠為一個值，146只共分成32個值，假手術組、腦出血組及腦梗死組為實際的大鼠只數）。

表1 各組寒潮前例數、血壓及血漿 TNF-α含量的比較

2.3 寒潮前血壓與 TNF-α水平的的關系 寒潮前手術組各組 TNF-α與血壓成正相（P＜0.01），見表2。

表2 寒潮前血壓與 TNF-α水平的關系

3 討論

現有腦卒中模型大多采用正常動物，與臨床腦血管病變基礎上發生的卒中有明顯差異。本研究前期工作顯示，采用雙腎雙夾法制作的 RHRSP模型，2周后血壓明顯升高，以后血壓逐漸升高，術后12周血壓高達（215±24）mmHg以上，病理檢查發現RHRSP腦內動脈硬化、管壁增厚及管腔狹窄，甚至血管破裂出血［4］；造模 40周自發性腦卒中的發生率高達61.8%，模擬了從高血壓發生到腦血管結構性破壞以及腦卒中的整個病理過程［3］。高血壓持續 12周后經歷人工寒潮，其卒中發生率為24.5%，其中腦出血占27%，腦梗死占73%。說明該模型經歷人工寒潮可以模擬高血壓患者在天氣變化時發生腦卒中，有利于進一步研究氣象因素促發腦卒中的機制以及預防。

近年來研究表明，炎性機制在高血壓及腦卒中病理病生過程中扮演一個重要的角色。TNF-α是由激活的巨噬細胞分泌的一種免疫細胞因子，又是一種重要的炎性細胞因子，在觸發高血壓炎癥反應中處于中心地位［5］。更為重要的是TNF-α有促動脈硬化形成，損傷小動脈，介導凋亡機制誘導神經細胞凋亡［6-7］，所以 TNF-α還參與腦血管病的誘發過程并影響病程，是缺血性腦卒中復發的強力預測因子［8］。本文研究顯示：寒潮前手術組TNF-α含量高于假手術組，且卒中組高于非卒中組（P＜0.001），腦出血組 TNF-α含量高于腦梗死組，但差異無顯著性。而TNF-α抑制劑可以透過血腦屏障，減少腦梗死面積，可能是減少卒中并發癥一條新途徑［7，9］。

我們進一步對高血壓各組血壓與 TNF-α做簡單相關分析發現：寒潮前手術組各組 TNF-α與血壓成正相關。而且血壓越高，這種變化就越明顯。TNF-α升高使得血管收縮和舒張不平衡；同時高血壓又能造成 TNF-α的過量釋放，進而形成互相促進的惡性循環［10］。無論是缺血性卒中還是腦出血的發病過程中都存在著 TNF-α介導的炎癥免疫反應，其中 TNF-α在這一過程中可能起關鍵作用。

綜上所述，持續高血壓使RHRSP血中的TNF-α明顯升高，且增加腦內動脈粥樣硬化風險。這些變化達到一定程度時在寒潮的刺激下便發生腦卒中，達到這種程度可以從 TNF-α的含量上反映，即TNF-α的含量達到一定程度 RHRSP在寒潮的刺激下發生腦卒中。我們的研究發現無論發生腦梗死還是腦出血的RHRSP寒潮前血中TNF-α的含量都較非卒中組明顯升高，且兩者的 TNF-α的含量隨血壓的升高而升高。提示持續的 TNF-α升高對高血壓患者發生腦卒中可能具有一定的預警作用。

但是 RHRSP經歷人工寒潮為什么一部分發生腦梗死而又有一部分發生腦出血呢，這需要我們進一步研究。

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Tumor necrosis factor-α could be used as the prediction index of stroke in hypertensive rats

LIU Shu-yun1，ZHANG Ping2，LIN Ren-yong1，et al
（1.Guanlan People’s Hospital of Neurology，Shenzhen，Guangdong 518110，China；2.Department of Neurology，Nanhua Affiliated Hospital of Nanhua University，Hengyang，Hunan 421002，China）

Objective To investigate changes of serum tumor necrosis factor-α（TNF-α）in stroke-prone renovascular hypertensive rats （RHRSP）before artificial cold and the possible prediction value of TNF-α.Methods Two-kidney，two-clip methods were used to copy the model of renovascular hypertension in rats.The levels of serum TNF-α were measured by enzyme-linked immunosorbant assay before artificial cold.Results The serum levels in cerebral infarction group and cerebral hemorrhage group were significantly higher than those in the non-stroke group before artificial cold；the contents of TNF-α in hypertension groups positively correlated with blood pressure.Conclusions The serum TNF-α levels could be used as the prediction index of stroke.

stroke；stroke-prone renovascular hypertensive rats；tumor necrosis factor-α；artificial cold

10.3969／j.issn.1009-6469.2014.03.018

2013-08-25，

2013-10-30）

湖南省自然科學基金（No 08JJ3036）

聶亞雄，男，主任醫師，碩士生導師，研究方向：腦血管病防治，E-mail：bridgeman1025＠yahoo.com.cn