不同取代度的寡聚精氨酸殼聚糖的合成與鑒定

何 文，劉 貝，郭咸希

（1.武漢大學人民醫院藥學部；2.武漢大學藥學院，湖北 武漢 430060）

不同取代度的寡聚精氨酸殼聚糖的合成與鑒定

何 文1，劉 貝2，郭咸希1

（1.武漢大學人民醫院藥學部；2.武漢大學藥學院，湖北 武漢 430060）

目的 合成不同分子量、不同取代度的寡聚精氨酸殼聚糖（CS-PR），并對其化學結構及取代度進行鑒定。方法 用高分子量殼聚糖（HCS）、低分子量殼聚糖（LCS）和寡聚精氨酸（R9）為主要原料，通過改變反應物的摩爾比，合成不同取代度 CSPR，應用FTIR及1H-NMR對其結構及取代度進行分析。結果 通過改變反應物的摩爾比，獲得了取代度為 0.96和 1.87的HCS-R9，以及取代度為2.61和10.10的 LCS-R9。結論 不同分子量不同取代度的 CS-PR合成成功，為進一步實驗奠定了基礎。

殼聚糖；寡聚精氨酸；合成；分子量；取代度

殼聚糖（chitosan，CS）是一種天然聚陽離子多糖，具有良好的生物降解性和生物相容性，是自然界唯一的堿性多糖，且來源廣泛，為地球上僅次于纖維素的第二大再生資源。CS分子不溶于一般的有機溶劑和水，在一定程度上限制了它的廣泛應用。利用 CS重復單元上的氨基，可對其進行化學改性，制備出具有不同理化特性的 CS衍生物，一方面可改善它們的溶解性能，更重要的是不同取代基的引入可賦予 CS更多的功能，從而延伸了 CS的應用領域和范圍。研究［1-3］表明：CS及其衍生物可促進藥物的透皮吸收，其效果甚至優于同濃度的氮酮。

細胞穿透肽（cell penetration peptides，CPP）是由10～30個氨基酸組成的短肽，可攜帶多種物質進行細胞間或細胞內傳輸，是一種新型的不引起細胞膜永久性損傷的載體，目前在細胞生物、基因治療學及制藥工程領域均顯示巨大的研究價 值［4-5］。CPP是以氨基酸為單位，多含有帶正電荷的精氨酸和賴氨酸，帶有大量的正電荷。本實驗所選用的具有細胞穿透肽的一般性質。近年來，有研究嘗試將CPP作為透皮吸收促進劑用于透皮給藥系統中。CPP通過干擾緊密的角質層結構，促進藥物的透皮吸 收［6-9］。

本實驗室前期將高分子量的殼聚糖（high molecular weight chitosan，HCS）與精氨酸九聚體（nonaarginine，R9）進行化學結合，即以HCS為載體，氨基側鏈采用親水性基團 R9進行修飾，已成功合成HCS-R9，并初步驗證了其透皮吸收促進作用。本實驗擬選用 HCS及低分子量的殼聚糖（low molecular weight chitosan，LCS），并通過調節 CS與 R9的摩爾比合成不同取代度的 CS-R9，為后期考察 CS分子量、取代度等因素對 CS-R9透皮吸收促進作用的影響奠定基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器 TG328A電子分析天平（上海天平儀器廠）；RE-52C旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；Alpha-4冷凍干燥機（德國Martin Christ）；HJ-3恒溫磁力攪拌器（江蘇金壇醫療儀器廠）；HH.S精密恒溫水浴鍋（江蘇金壇醫療儀器廠）；A-VATAR360傅立葉紅外光譜儀（美國Thermo Nicolet公司）；Varian unity-600核磁共 振 譜儀 （美國 Varian公 司）；ZKF030電熱真空干燥箱（上海實驗儀器廠）；透析袋（MW8000-14000，USA）。

1.2 試藥 HCS（MW 5.9×105，DD≥95%，國藥集團化學試劑有限公司，批號：20121112）；LCS（MW 5.0×104，DD≥85%，浙江金殼藥業有限公司，批號：D130531089）；R9（95%，委托南京金斯瑞公司合成）；N-羥基硫代琥珀酰亞胺（NHS，分析純，國藥集團化學試劑有限公司，批號：20120830）；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl，99%，上 海 共 價 化 學 科 技 有 限 公 司，批號：20121009）；二碳酸二叔丁酯（Boc，國藥集團化學試劑有限公司，批號：20121210）；氧化氘（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20120220）；氘代乙酸（北京百靈威科技有限公司，批號：LS30N38）。

2 方法

2.1 CS-R9的合成［10-11］本實驗的合成思路如圖1。基本思路是 R9的羧基經 EDC和 Sulfo-NHS的活化與 CS的氨基發生反應，反應在室溫下進行。

圖1 CS-PR的合成路線

2.1.1 低取代 HCS-R9的制備 取 20 mg R9溶于10 mL去離子水中，另取16 mg Boc溶于10 mL四氫呋喃中，將溶有 Boc酸酐的四氫呋喃溶液加入到R9的水溶液中，攪拌均勻，用1 mol·L-1的NaOH溶液調節混合溶液的pH值至9～10，恒溫攪拌反應24 h后，停止反應。將反應液置于旋轉蒸發儀上除去部分四氫呋喃—水混合液，取適量去離子水將其溶解，得反應液1。

稱取281 mg HCS加入到30 mL的1%的冰醋酸水溶液中，室溫攪拌12 h，使 HCS完全溶解，用電子分析天平稱取5.6 mg NHS和24 mg EDC，加入到HCS溶液中，再將反應液1加入到此溶液中，調 pH 為6.0，開啟磁力攪拌，在室溫下攪拌反應 48 h后，停止攪拌。加入1%的 CF3COOH消除 Boc保護。加入50%羥胺使其終濃度為 10 mM，調節pH至8.0，使反應停止。流反應 R9與 HCS摩爾比為10∶1。

將反應液裝入透析袋（MW＝8 000～14 000）中，浸沒在去離子水中透析 48 h，然后冷凍干燥，得到產物HCS-R9-1。

2.1.2 高取代 HCS-R9的制備 采用 2.1.1中的方法使 R9與 HCS以40∶1的摩爾比發生反應，經過透析、冷凍干燥，得到產物HCS-R9-2。

2.1.3 低取代 LCS-R9的制備 采用2.1.1中的方法使R9與 LCS以 5∶1的摩爾比發生反應，經過透析、冷凍干燥，得到產物 LCS-R9-1。

2.1.4 高取代 LCS-R9的制備 采用 2.1.1中的方法使R9與LCS以35∶1的摩爾比發生反應，經過透析、冷凍干燥，得到產物LCS-R9-2。

2.2 CS-PR的結構鑒定［12］

2.2.1 傅里葉紅外光譜分析（FTIR） 分別取適量的CS、R9、HCS-R9-1、HCS-R9-2、LCS-R9-1、LCS-R9-2凍干粉末，與干燥的 KBr粉末以 1∶100的質量比混勻并溶于適量去離子水，烘干，用瑪瑙研缽研成細粉末，將此混合物壓片，置于傅氏轉換紅外線光譜分析儀（FTIR）內掃描，掃描范圍：4 000～400 cm-1，記錄其紅外光譜。

2.2.21H-核磁共振譜（1H-NMR） 取適量的 CS、R9、HCS-R9-1、HCS-R9-2、LCS-R9-1、LCS-R9-2，分別溶于體積比為 5∶95的 CD3COOD∶D2O中，在 150 MHz頻率照射，20℃下核磁共振儀記錄圖譜。

3 結果

3.1 產物的紅外譜圖 見圖 2。由圖 2可知，R9 在1 652和1 153 cm-1處分別有R9的胍基 C＝N特征峰和C-C-N鍵的非對稱伸縮吸收峰，1 271 cm-1處有 C（O）-O的伸縮振動吸收峰，1 139 cm-1處有C-N伸縮振動吸收峰；HCS及LCS在1 637 cm-1處有 NH2鍵的彎曲振動吸收峰，1 563 cm-1處有C＝O鍵的非對稱伸縮振動吸收特征峰，1 077 cm-1處有吡喃環上的 C-O伸縮振動吸收峰，1 153 cm-1處有C-C-N鍵的非對稱彎曲振動吸收峰；HCS-R9-1和HCS-R9-2以及 LCS-R9-1和 LCS-R9-2在 1 580 cm-1處有酰胺鍵的吸收峰，這表明 HCS和 LCS與R9形成酰胺鍵［13］。通過紅外光譜的測試分析，能夠初步判斷HCS-R9及 LCS-R9的成功連接。

圖2 化合物的 FTIR譜圖

3.2 產物的核磁譜圖 為進一步確證HCS、LCS與R9的連接成功，進行了核磁共振氫譜的測定。由圖3中未修飾的殼聚糖的譜圖，在以下位置可觀測到化學位移：δ＝5.23（H 1），δ＝3.0（H 2），δ＝3.50～3.80（H 3，H 4，H 5，H 6），δ＝1.90 ppm（NHCOCH3）。經修飾后，化學位移在 δ＝1.5（CONHCHCH2CH2-）、δ＝1.7（CONH-CHCH2-）處出現的質子峰，在 δ＝4.2（CONH-CH-）處出現的骨架質子峰，都可以表明 R9連接到了 CS上［14］。

圖3 A：CS-PR結構式；B：R9、CS、CS-R9的1H-NMR譜圖 （其中圓圈代表δ＝3.0，CS上2號碳上的質子，-CH-；星號代表δ＝4.2，R9上2號碳上的質子，-CH-）

3.3 產物取代度的確定 CS-PR的取代度，定義為R9與 CS的 100個葡聚糖單體的摩爾比［15］。由圖4可知，HCS-R9-1、HCS-R9-2、LCS-R9-1、LCS-R9-2的 R9上2號碳上質子與 CS上 2號碳上質子的積分面積比分別為1∶11.58、1∶5.95、1∶4.25、1∶1.1。由此根據以下公式：

圖4 各化合物的質子積分面積

其中：［substituent］：取代基團R9上2號碳的質子數；［H］：CS上2號碳的質子數；n：取代基團上2號碳的總數。由此可以計算出本實驗所合成的CS-PR的取代度如下：HCS-R9-1：0.96；HCS-R9-2：1.87；LCS-R9-1：2.61；LCS-R9-2：10.10。

4 討論

本實驗所選用的起始原料殼聚糖和寡聚精氨酸均具有促進透皮吸收的作用，故猜想殼聚糖的寡聚精氨酸修飾物具有更強的促進作用。而前期所做的實驗，也驗證了HCS-R9具有一定的促進透皮吸收的作用。分子量對于高分子化合物的性質會有很大的影響。因此本實驗選用了不同分子量的 CS與 R9結合，并通過改變其摩爾比成功合成了不同取代度的CS-R9。先前查閱了一些文獻，有研究［11］表明通過改變反應物的摩爾比可以改變取代度，但尚未見有摩爾比與取代度具體對應關系的報道。本實驗室之前嘗試過 R9與 HCS摩爾比為5∶1的反應，但因其取代度較低，1H-NMR的譜圖與未取代的 HCS幾乎無差異，且考慮到HCS分子遠遠大于R9分子，如若取代度過低，不能使產物發揮預期的優于反應物的透皮吸收促進作用，于是提高了摩爾比，以獲得取代度更高的HCS-PR。因之前未進行過 LCS與 R9的反應，不知其摩爾比與取代度關系如何，因此本實驗進行了摩爾比差異較大的兩組實驗。本實驗為后期研究反應物的摩爾比與取代度的關系以及考察殼聚糖分子量、取代度對透皮吸收促進作用的影響奠定了基礎。

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Synthesis and characterization of chitosan modified nonaarginine with different degrees of substitution

HE Wen1，LIU Bei2，GUO Xian-xi1
（1.Department of Pharmacy，Renmin Hospital of Wuhan University；2.School of Pharmaceutical Sciences，Wuhan University，Wuhan，Hubei 430060，China）

Objective To synthesize chitosan modified nonaarginine（CS-R9）with different degrees of substitution（DS）and to characterize the structure and DS by FTIR and 1H-NMR.Methods R9 and CS with high molecular weight（HCS）or low molecular weight （LCS）as the raw materials，a series of CS-R9 with different DS were synthesized by changing the mole ratio between them.The structure and DS of CS-R9 was characterized by FTIR and1HNMR.Results A series of CS-R9 was synthesized including HCS-R9 with the DS of 0.96 and 1.87，LCS-R9 with the DS of 2.61 and 10.10，respectively.Conclusions CS-R9 with different DS was synthesized successfully，which provides the basis for the further studies.

chitosan；nonaarginine；synthesis；molecular weight；substitution

10.3969／j.issn.1009-6469.2014.05.010

2013-10-29）