新疆昌吉地區大腸桿菌致奶牛隱性乳房炎的調查與分析

賈林軍　蘇艷

摘要：為解大腸桿菌在新疆昌吉地區奶牛隱性乳房炎流行中所起的作用，試驗對昌吉地區奶牛隱性乳房炎病牛乳樣進行了大腸桿菌的分離、鑒定及耐藥性研究。結果表明，昌吉地區規模化奶牛場的隱性乳房炎陽性率為40.8%，從671份乳樣中分離出大腸桿菌64株，占樣本數的9.5%，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌三種細菌總數的32.16%。藥敏試驗結果表明鑒定出的64株大腸桿菌對氧氟沙星、頭孢唑林、克林霉素敏感；對青霉素、慶大霉素、氨芐西林中度敏感；對鏈霉素、四環素有耐藥性。

關鍵詞：昌吉地區；大腸桿菌；奶牛乳房炎；調查與分析

中圖分類號：S858.23 文獻標識碼：A 文章編號：1007-273X（2014）01-0005-03

奶牛乳房炎的發病原因是復雜多樣的，主要包括物理因素、化學因素和微生物因素，其嚴重影響產奶量，因此，奶牛隱性乳房炎的防治是一個急需解決的問題。腸桿菌科中的埃希氏大腸桿菌是導致奶牛乳房炎的重要環境病原菌之一。為了解大腸桿菌在新疆昌吉地區奶牛隱性乳房炎流行中所起的作用，試驗對昌吉地區奶牛隱性乳房炎病牛乳樣進行了大腸桿菌的分離、鑒定及耐藥性研究，旨在為科學防治奶牛乳房炎提供科學依據。

1 試驗材料

1.1 樣品來源

新鮮乳樣671份，來自新疆昌吉地區6個規模化牛場的196頭奶牛隱性乳房炎病牛。

1.2 主要儀器

恒溫培養振蕩器、隔水式恒溫培養箱、電熱恒溫培養箱，生物顯微鏡、超凈工作臺，法國生物梅里埃公司VITEK-2全自動生化分析儀、立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋，試管、培養皿若干，奶牛隱性乳房炎診斷盤。

1.3 培養基及試劑

LB液體培養基、LB固體培養基、麥康凱瓊脂培養基、革蘭氏染液。

1.4 藥敏紙片

氨芐西林、青霉素、氧氟沙星、阿莫西林、鏈霉素、四環素、克林霉素、慶大霉素、頭孢唑啉均購自杭州微生物試劑有限公司。

2 試驗方法

2.1 隱性乳房炎的檢測與奶樣的采集

選取隱性乳房炎陽性奶牛，記錄其耳號，常規無菌操作進行人工擠乳，棄去頭三把乳汁，從每個乳頭取奶2 mL于5 mL EP管內，做好標記，置于放有冰帶的采樣箱內，盡快送至實驗室，-20 ℃保存備用。

2.2 細菌的分離培養與純化

2.2.1 細菌的培養 將乳樣反復凍融4次后，每份取50 μL接種于LB肉湯中，作好標記，置于37 ℃恒溫培養箱內，220 r/min振蕩培養18～24 h。

2.2.2 液體培養物的涂片觀察 取出后用接種環取一環菌液涂片固定，通過革蘭氏染色法進行染色后用油鏡觀察其形態，包括菌體顏色、大小、形狀，有無芽孢形成，有無鞭毛等。

在麥康凱培養基、LB固體培養基上進行四區劃線，倒扣于37 ℃恒溫培養箱內培養12～18 h。

2.3 分離菌的形態學鑒定

觀察麥康凱培養基和LB固體培養基上群落的生長狀況，包括大小、形狀、顏色、表面光滑程度等。

菌體形態：從麥康凱上挑取圓形、紅色、菌落中部為黑色的菌落進行染色。取潔凈的載玻片，滴加一小滴生理鹽水，將接種環燃燒后蘸取少量菌體接種到水滴上，涂抹均勻，晾干，染色觀察。

挑取形狀規則、菌落偏小、表面光滑、中間為黑色的菌落，接種到LB液體培養基內，培養18 h，再次四區劃線，挑取單個菌落，染色觀察。如此重復，直至菌體在顯微鏡下觀察時形態完全一致時，將單個菌落接種于LB斜面培養基上，4 ℃保存備用。

2.4 生理生化特性鑒定

采用法國生物梅里埃公司VITEK-2分析儀GN鑒定卡進行分析，嚴格按儀器要求操作。

2.4.1 比濁管的制備 根據培養特性和鏡檢結果，上一步所分離的疑似大腸桿菌接種于斜面，培養18 h，用接種環由外到內刮取菌落接種到事先準備好的專用比濁管內，劇烈震蕩，使菌體懸浮，振蕩后立刻插入比濁儀，測定其OD值，作好標記，當OD值在0.5～1.0之間時，方可用于生化特性分析鑒定。

將制備好的比濁管放入法國生物梅里埃公司VITEK-2分析儀，每管放入一個革蘭氏陰性菌鑒定卡，將比濁管號輸入電腦，按說明書設定好程序。18 h后讀取并打印鑒定結果。

2.5 藥物敏感試驗

挑取經過鑒定，確定為埃希氏大腸桿菌的菌株進行藥物敏感試驗。采用Kirby±Bauer瓊脂擴散法操作， 測定大腸桿菌對抗生素藥物的敏感性。詳見下表1。

3 結果與分析

3.1 乳樣的采集

從新疆昌吉地區6個規模化奶牛場196頭隱性乳房炎病牛采得乳樣671份。

3.2 細菌分離鑒定結果

從671份奶樣中分離出疑似埃希氏大腸桿菌93株，經VITEK 2全自動生化鑒定儀鑒定出64株埃希氏大腸桿菌，占采集奶樣份數的9.5%。

3.3 藥敏試驗結果

藥敏試驗結果（表2）表明，該地區乳汁分離的大腸桿菌對青霉素、氨芐西林、鏈霉素、四環素呈現較強的耐藥性，其中鏈霉素耐藥率最高，為68.74%，對頭孢唑林、氧氟沙星，克林霉素較為敏感。頭孢唑林敏感率最高，為32.81%。

4 小結及討論

本試驗無菌采集了新疆昌吉地區6個規模化奶牛場的196頭經檢測為奶牛隱性乳房炎陽性奶牛的乳樣共671份，采用常規的微生物學方法對乳樣進行了細菌分離鑒定和藥敏試驗。細菌生化鑒定采用微生物鑒定儀（VITEK2）進行鑒定，藥敏試驗采用紙片法。結果表明，新疆昌吉地區規模化奶牛場的隱性乳房炎陽性率為40.8%，從671份乳樣中分離出大腸桿菌64株，占樣本數的9.5%，占大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌3種細菌總數的32.16%（64/199）。藥敏試驗結果表明鑒定出的64株大腸桿菌對氧氟沙星、頭孢唑林、克林霉素敏感；對青霉素、慶大霉素、氨芐西林中度敏感；對鏈霉素、四環素有耐藥性。為大腸桿菌引起的隱形乳房炎提供了預防和治療的依據。

由此看來，大腸桿菌在奶牛隱性乳房炎致病菌中所占比例在不同地區存在較大的差異，這可能與不同地區的生物環境及牛場用藥制度有關。

摘要：為解大腸桿菌在新疆昌吉地區奶牛隱性乳房炎流行中所起的作用，試驗對昌吉地區奶牛隱性乳房炎病牛乳樣進行了大腸桿菌的分離、鑒定及耐藥性研究。結果表明，昌吉地區規模化奶牛場的隱性乳房炎陽性率為40.8%，從671份乳樣中分離出大腸桿菌64株，占樣本數的9.5%，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌三種細菌總數的32.16%。藥敏試驗結果表明鑒定出的64株大腸桿菌對氧氟沙星、頭孢唑林、克林霉素敏感；對青霉素、慶大霉素、氨芐西林中度敏感；對鏈霉素、四環素有耐藥性。

關鍵詞：昌吉地區；大腸桿菌；奶牛乳房炎；調查與分析

中圖分類號：S858.23 文獻標識碼：A 文章編號：1007-273X（2014）01-0005-03

奶牛乳房炎的發病原因是復雜多樣的，主要包括物理因素、化學因素和微生物因素，其嚴重影響產奶量，因此，奶牛隱性乳房炎的防治是一個急需解決的問題。腸桿菌科中的埃希氏大腸桿菌是導致奶牛乳房炎的重要環境病原菌之一。為了解大腸桿菌在新疆昌吉地區奶牛隱性乳房炎流行中所起的作用，試驗對昌吉地區奶牛隱性乳房炎病牛乳樣進行了大腸桿菌的分離、鑒定及耐藥性研究，旨在為科學防治奶牛乳房炎提供科學依據。

1 試驗材料

1.1 樣品來源

新鮮乳樣671份，來自新疆昌吉地區6個規模化牛場的196頭奶牛隱性乳房炎病牛。

1.2 主要儀器

恒溫培養振蕩器、隔水式恒溫培養箱、電熱恒溫培養箱，生物顯微鏡、超凈工作臺，法國生物梅里埃公司VITEK-2全自動生化分析儀、立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋，試管、培養皿若干，奶牛隱性乳房炎診斷盤。

1.3 培養基及試劑

LB液體培養基、LB固體培養基、麥康凱瓊脂培養基、革蘭氏染液。

1.4 藥敏紙片

氨芐西林、青霉素、氧氟沙星、阿莫西林、鏈霉素、四環素、克林霉素、慶大霉素、頭孢唑啉均購自杭州微生物試劑有限公司。

2 試驗方法

2.1 隱性乳房炎的檢測與奶樣的采集

選取隱性乳房炎陽性奶牛，記錄其耳號，常規無菌操作進行人工擠乳，棄去頭三把乳汁，從每個乳頭取奶2 mL于5 mL EP管內，做好標記，置于放有冰帶的采樣箱內，盡快送至實驗室，-20 ℃保存備用。

2.2 細菌的分離培養與純化

2.2.1 細菌的培養 將乳樣反復凍融4次后，每份取50 μL接種于LB肉湯中，作好標記，置于37 ℃恒溫培養箱內，220 r/min振蕩培養18～24 h。

2.2.2 液體培養物的涂片觀察 取出后用接種環取一環菌液涂片固定，通過革蘭氏染色法進行染色后用油鏡觀察其形態，包括菌體顏色、大小、形狀，有無芽孢形成，有無鞭毛等。

在麥康凱培養基、LB固體培養基上進行四區劃線，倒扣于37 ℃恒溫培養箱內培養12～18 h。

2.3 分離菌的形態學鑒定

觀察麥康凱培養基和LB固體培養基上群落的生長狀況，包括大小、形狀、顏色、表面光滑程度等。

菌體形態：從麥康凱上挑取圓形、紅色、菌落中部為黑色的菌落進行染色。取潔凈的載玻片，滴加一小滴生理鹽水，將接種環燃燒后蘸取少量菌體接種到水滴上，涂抹均勻，晾干，染色觀察。

挑取形狀規則、菌落偏小、表面光滑、中間為黑色的菌落，接種到LB液體培養基內，培養18 h，再次四區劃線，挑取單個菌落，染色觀察。如此重復，直至菌體在顯微鏡下觀察時形態完全一致時，將單個菌落接種于LB斜面培養基上，4 ℃保存備用。

2.4 生理生化特性鑒定

采用法國生物梅里埃公司VITEK-2分析儀GN鑒定卡進行分析，嚴格按儀器要求操作。

2.4.1 比濁管的制備 根據培養特性和鏡檢結果，上一步所分離的疑似大腸桿菌接種于斜面，培養18 h，用接種環由外到內刮取菌落接種到事先準備好的專用比濁管內，劇烈震蕩，使菌體懸浮，振蕩后立刻插入比濁儀，測定其OD值，作好標記，當OD值在0.5～1.0之間時，方可用于生化特性分析鑒定。

將制備好的比濁管放入法國生物梅里埃公司VITEK-2分析儀，每管放入一個革蘭氏陰性菌鑒定卡，將比濁管號輸入電腦，按說明書設定好程序。18 h后讀取并打印鑒定結果。

2.5 藥物敏感試驗

挑取經過鑒定，確定為埃希氏大腸桿菌的菌株進行藥物敏感試驗。采用Kirby±Bauer瓊脂擴散法操作， 測定大腸桿菌對抗生素藥物的敏感性。詳見下表1。

3 結果與分析

3.1 乳樣的采集

從新疆昌吉地區6個規模化奶牛場196頭隱性乳房炎病牛采得乳樣671份。

3.2 細菌分離鑒定結果

從671份奶樣中分離出疑似埃希氏大腸桿菌93株，經VITEK 2全自動生化鑒定儀鑒定出64株埃希氏大腸桿菌，占采集奶樣份數的9.5%。

3.3 藥敏試驗結果

藥敏試驗結果（表2）表明，該地區乳汁分離的大腸桿菌對青霉素、氨芐西林、鏈霉素、四環素呈現較強的耐藥性，其中鏈霉素耐藥率最高，為68.74%，對頭孢唑林、氧氟沙星，克林霉素較為敏感。頭孢唑林敏感率最高，為32.81%。

4 小結及討論

本試驗無菌采集了新疆昌吉地區6個規模化奶牛場的196頭經檢測為奶牛隱性乳房炎陽性奶牛的乳樣共671份，采用常規的微生物學方法對乳樣進行了細菌分離鑒定和藥敏試驗。細菌生化鑒定采用微生物鑒定儀（VITEK2）進行鑒定，藥敏試驗采用紙片法。結果表明，新疆昌吉地區規模化奶牛場的隱性乳房炎陽性率為40.8%，從671份乳樣中分離出大腸桿菌64株，占樣本數的9.5%，占大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌3種細菌總數的32.16%（64/199）。藥敏試驗結果表明鑒定出的64株大腸桿菌對氧氟沙星、頭孢唑林、克林霉素敏感；對青霉素、慶大霉素、氨芐西林中度敏感；對鏈霉素、四環素有耐藥性。為大腸桿菌引起的隱形乳房炎提供了預防和治療的依據。

由此看來，大腸桿菌在奶牛隱性乳房炎致病菌中所占比例在不同地區存在較大的差異，這可能與不同地區的生物環境及牛場用藥制度有關。

摘要：為解大腸桿菌在新疆昌吉地區奶牛隱性乳房炎流行中所起的作用，試驗對昌吉地區奶牛隱性乳房炎病牛乳樣進行了大腸桿菌的分離、鑒定及耐藥性研究。結果表明，昌吉地區規模化奶牛場的隱性乳房炎陽性率為40.8%，從671份乳樣中分離出大腸桿菌64株，占樣本數的9.5%，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌三種細菌總數的32.16%。藥敏試驗結果表明鑒定出的64株大腸桿菌對氧氟沙星、頭孢唑林、克林霉素敏感；對青霉素、慶大霉素、氨芐西林中度敏感；對鏈霉素、四環素有耐藥性。

關鍵詞：昌吉地區；大腸桿菌；奶牛乳房炎；調查與分析

中圖分類號：S858.23 文獻標識碼：A 文章編號：1007-273X（2014）01-0005-03

奶牛乳房炎的發病原因是復雜多樣的，主要包括物理因素、化學因素和微生物因素，其嚴重影響產奶量，因此，奶牛隱性乳房炎的防治是一個急需解決的問題。腸桿菌科中的埃希氏大腸桿菌是導致奶牛乳房炎的重要環境病原菌之一。為了解大腸桿菌在新疆昌吉地區奶牛隱性乳房炎流行中所起的作用，試驗對昌吉地區奶牛隱性乳房炎病牛乳樣進行了大腸桿菌的分離、鑒定及耐藥性研究，旨在為科學防治奶牛乳房炎提供科學依據。

1 試驗材料

1.1 樣品來源

新鮮乳樣671份，來自新疆昌吉地區6個規模化牛場的196頭奶牛隱性乳房炎病牛。

1.2 主要儀器

恒溫培養振蕩器、隔水式恒溫培養箱、電熱恒溫培養箱，生物顯微鏡、超凈工作臺，法國生物梅里埃公司VITEK-2全自動生化分析儀、立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋，試管、培養皿若干，奶牛隱性乳房炎診斷盤。

1.3 培養基及試劑

LB液體培養基、LB固體培養基、麥康凱瓊脂培養基、革蘭氏染液。

1.4 藥敏紙片

氨芐西林、青霉素、氧氟沙星、阿莫西林、鏈霉素、四環素、克林霉素、慶大霉素、頭孢唑啉均購自杭州微生物試劑有限公司。

2 試驗方法

2.1 隱性乳房炎的檢測與奶樣的采集

選取隱性乳房炎陽性奶牛，記錄其耳號，常規無菌操作進行人工擠乳，棄去頭三把乳汁，從每個乳頭取奶2 mL于5 mL EP管內，做好標記，置于放有冰帶的采樣箱內，盡快送至實驗室，-20 ℃保存備用。

2.2 細菌的分離培養與純化

2.2.1 細菌的培養 將乳樣反復凍融4次后，每份取50 μL接種于LB肉湯中，作好標記，置于37 ℃恒溫培養箱內，220 r/min振蕩培養18～24 h。

2.2.2 液體培養物的涂片觀察 取出后用接種環取一環菌液涂片固定，通過革蘭氏染色法進行染色后用油鏡觀察其形態，包括菌體顏色、大小、形狀，有無芽孢形成，有無鞭毛等。

在麥康凱培養基、LB固體培養基上進行四區劃線，倒扣于37 ℃恒溫培養箱內培養12～18 h。

2.3 分離菌的形態學鑒定

觀察麥康凱培養基和LB固體培養基上群落的生長狀況，包括大小、形狀、顏色、表面光滑程度等。

菌體形態：從麥康凱上挑取圓形、紅色、菌落中部為黑色的菌落進行染色。取潔凈的載玻片，滴加一小滴生理鹽水，將接種環燃燒后蘸取少量菌體接種到水滴上，涂抹均勻，晾干，染色觀察。

挑取形狀規則、菌落偏小、表面光滑、中間為黑色的菌落，接種到LB液體培養基內，培養18 h，再次四區劃線，挑取單個菌落，染色觀察。如此重復，直至菌體在顯微鏡下觀察時形態完全一致時，將單個菌落接種于LB斜面培養基上，4 ℃保存備用。

2.4 生理生化特性鑒定

采用法國生物梅里埃公司VITEK-2分析儀GN鑒定卡進行分析，嚴格按儀器要求操作。

2.4.1 比濁管的制備 根據培養特性和鏡檢結果，上一步所分離的疑似大腸桿菌接種于斜面，培養18 h，用接種環由外到內刮取菌落接種到事先準備好的專用比濁管內，劇烈震蕩，使菌體懸浮，振蕩后立刻插入比濁儀，測定其OD值，作好標記，當OD值在0.5～1.0之間時，方可用于生化特性分析鑒定。

將制備好的比濁管放入法國生物梅里埃公司VITEK-2分析儀，每管放入一個革蘭氏陰性菌鑒定卡，將比濁管號輸入電腦，按說明書設定好程序。18 h后讀取并打印鑒定結果。

2.5 藥物敏感試驗

挑取經過鑒定，確定為埃希氏大腸桿菌的菌株進行藥物敏感試驗。采用Kirby±Bauer瓊脂擴散法操作， 測定大腸桿菌對抗生素藥物的敏感性。詳見下表1。

3 結果與分析

3.1 乳樣的采集

從新疆昌吉地區6個規模化奶牛場196頭隱性乳房炎病牛采得乳樣671份。

3.2 細菌分離鑒定結果

從671份奶樣中分離出疑似埃希氏大腸桿菌93株，經VITEK 2全自動生化鑒定儀鑒定出64株埃希氏大腸桿菌，占采集奶樣份數的9.5%。

3.3 藥敏試驗結果

藥敏試驗結果（表2）表明，該地區乳汁分離的大腸桿菌對青霉素、氨芐西林、鏈霉素、四環素呈現較強的耐藥性，其中鏈霉素耐藥率最高，為68.74%，對頭孢唑林、氧氟沙星，克林霉素較為敏感。頭孢唑林敏感率最高，為32.81%。

4 小結及討論

本試驗無菌采集了新疆昌吉地區6個規模化奶牛場的196頭經檢測為奶牛隱性乳房炎陽性奶牛的乳樣共671份，采用常規的微生物學方法對乳樣進行了細菌分離鑒定和藥敏試驗。細菌生化鑒定采用微生物鑒定儀（VITEK2）進行鑒定，藥敏試驗采用紙片法。結果表明，新疆昌吉地區規模化奶牛場的隱性乳房炎陽性率為40.8%，從671份乳樣中分離出大腸桿菌64株，占樣本數的9.5%，占大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌3種細菌總數的32.16%（64/199）。藥敏試驗結果表明鑒定出的64株大腸桿菌對氧氟沙星、頭孢唑林、克林霉素敏感；對青霉素、慶大霉素、氨芐西林中度敏感；對鏈霉素、四環素有耐藥性。為大腸桿菌引起的隱形乳房炎提供了預防和治療的依據。

由此看來，大腸桿菌在奶牛隱性乳房炎致病菌中所占比例在不同地區存在較大的差異，這可能與不同地區的生物環境及牛場用藥制度有關。