大豆耐鹽基因的預測與篩選

原 野

（復旦大學 生命科學學院，上海 200433）

大豆耐鹽基因的預測與篩選

原 野

（復旦大學 生命科學學院，上海 200433）

本研究運用生物信息學方法和實驗驗證，對大豆的3號染色體上Satt339～Sat304區間內耐鹽相關基因進行了結構和功能預測，篩選大豆的耐鹽性狀相關基因。通過實時熒光PCR技術，定量分析候選基因響應于鹽脅迫。

大豆；耐鹽基因；生物信息學；基因篩選

作為我國重要的經濟作物之一，大豆的耐鹽性較敏感，尤其在我國北方地區，可用耕地多為鹽性土壤，對大豆的生長影響較大。因此，找到耐鹽基因，解決大豆的耐鹽問題是克服土壤鹽漬化的重要前提[1]，是我國農業經濟可持續發展的關鍵。已有的研究表明，植物的抗鹽性是一個由多基因控制的數量性狀，其抗性機制是一個十分復雜的問題[2]，涉及植物器官、組織、細胞、細胞器直至分子，既有蛋白質、核酸、碳水化合物等結構和能量物質的代謝，還有激素合成、抗氧化酶活化、離子調控與區域化、滲透調節物質合成及基因表達[3]，許多基因會隨環境中鹽濃度的改變而改變表達量[4]。而過高的土壤含鹽量會對植株造成包括水分脅迫、離子脅迫、光合作用下降等多方面不利影響[5-12]，等。國外文獻中刊載的相關研究[13-16]是針對農作物耐鹽性的研究[12，15，17，18]，Mansour(2004)等主要是和對植物耐鹽性狀分子機理的研究。以往的研究中，對于大豆的耐鹽性狀研究尚顯薄弱。正是基于此現狀的啟發，確定以大豆為研究對象，應用Softberry的ORF預測功能和美國國立生物技術信息中心（NCBI）的BLAST檢索系統獲取大豆基因的基因結構并進行生物信息學分析，了解基因可能的功能，高效地縮小大豆耐鹽候選基因的范圍。在得到大豆耐鹽候選基因后，通過對大豆植株進行DNA酶切和PCR擴增，驗證候選基因的存在。繼而對大豆植株進行鹽脅迫，通過運用實時熒光PCR技術，定量驗證目的基因響應于大豆植株受到的鹽脅迫。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用合豐39大豆種由上海交通大學生命科學學院提供。

1.2 大豆耐鹽基因的篩選

大豆耐鹽候選基因的篩選即通過生物信息學方法，分析大豆基因序列，在不少于1.4Mbp的序列內分析基因功能，預測與大豆耐鹽性相關的基因。通過phytozome網站，得到大豆的全基因組序列，并在標記基因JD33前后，在Gm03染色體上標記基因Satt339～Sat304之間，選取約1.4Mbp的DNA序列，通過Softberry的FGENESH分析，得到預測基因序列。

通過NCBI的BLAST分析 （蛋白質序列），將預測的ORF（開放閱讀框）與基因庫（Gene Bank）的雙子葉植物數據庫進行比對，篩選同源序列。根據序列相似程度（E值、Score值）以及基因組成，對基因進行綜合分析，從而排除不完整的基因片段。

根據已注釋的直系同源基因的功能對大豆ORF的功能進行預測，確定與耐鹽相關的候選基因。

1.3 候選基因的PCR驗證

大豆耐鹽閾值，即當外界土壤或水中鹽濃度 （以NaCl計）超過時植株生長開始受到嚴重影響，如枝葉萎靡、生長驟緩、葉片出現斑點等，是大豆耐鹽性的重要指標。測定合豐39大豆耐鹽閾值，即作為植株鹽脅迫實驗的標準濃度。

選飽滿、色澤亮黃的大豆種，分組置于培養皿中，置于干燥器中，加100ml NaClO溶液（84消毒液）與1.5ml 37%HCl，滅菌24小時。將大豆種置于1.2%水瓊脂培養基上，4℃春化24小時；轉入光照培養箱中，培養3～5天。大豆出芽后，轉入50% 霍格蘭氏培養液，光照培養箱中，光照16小時/天，23℃持續水培。

配置含鹽霍格蘭氏工作液 （50%濃度），NaCl濃度梯度為 0mmol/L、0mmol/L （ 對 照 組 ）、20mmol/L、40mmol/L、60mmol/L、80mmol/L、100mmol/L、120mmol/L、150mmol/L， 共9組，每組9或10株，光照16小時/天，24～25℃，每3日更換含鹽培養液，持續水培。

第二周期在前一周期試驗的基礎上，NaCl濃度梯度為0mmol/L（對照組）、40mmol/L、45mmol/L、50mmol/L、55mmol/L、60mmol/L，共六組，其余條件同上。

鹽脅迫兩周后取樣。隨機抽取每組植株一株，記錄植株生長情況，包括第一、第二對真葉葉長、根長、莖長和植株出現的特殊狀況，如葉上長癍，莖葉萎靡等。觀察分析得到實驗中合豐39大豆的耐鹽閾值。

通過生物信息學方法，我們已經獲得了大豆耐鹽相關的候選基因。但其中很有可能仍包括一些不完整的基因片段。于是，我們對候選基因進行實驗驗證。

在對候選基因的進一步分析、選優過程中，我們發現個別基因過短、保守域在基因中所占比例過大，難以設計合適的PCR引物的情況。借助計算機軟件Primer Premier 5.0，設計CG含量介于40%～60%、一對3’～5’和5’～3’引物退火溫度相差不超過5℃、引物長度介于18～25bp之間、PCR產物在300bp以上的對應引物，并盡量確保沒有發卡或回文結構。

采用合豐39大豆耐鹽閾值濃度50mmol/L NaCl的50%霍格蘭氏培養液，對水培植株進行鹽脅迫12小時，共5株。

取每棵植株第一片、第二片真葉各一片，一部分根。剪下植株組織后迅速置于10ml離心管中，標記后置于液氮中保存。

使用康為RNA pure Plant Kit試劑盒提植物RNA，將獲得的 RNA溶液10μL， 向其中加入 1μL oligodT（50mmol/L），混勻離心，置于70℃水浴5分鐘。取出后立刻冰浴5分鐘。后向其中加入：

4μL 5×反轉錄酶的 Buffer；1μL反轉錄酶；0.5μL RNA酶 抑 制 劑 ；2.4μL Mg離 子 溶 液 （2.5mM）；1.1μL dNTPs（2.5mM）混勻后，25℃水浴5分鐘，再置于42℃水浴1小時，得到cDNA。

使 用 溫度梯度 PCR方 法， 從 51、53、55、56、57℃至59℃，共六個溫度梯度，40個循環，平行進行PCR擴增：

25μL System：2.5μL dNTPs；2.5μL 10×Taq buffer；0.5μL模板 cDNA；0.25μL正向引物S；0.25μL反向引物A；18.5μL水；0.5μL Taq酶。

配置1%瓊脂，冷凝后加入樣本、Marker，110V電泳，30分鐘后用EB染色，拍照。根據Marker條帶，估計PCR產物大小。并根據樣本條帶亮度，與對照組對比，估算濃度。

通過實驗，排除未能正常擴增的基因片段或不響應與大豆鹽脅迫的基因。

1.4 實時熒光定量PCR測定預測基因表達量

通過普通PCR擴增與瓊脂糖凝膠電泳實驗，可以證明實驗選取的一部分基因是在大豆植株中存在并與耐鹽有關的。而實時熒光定量PCR實驗可以定量檢測預測基因在大豆植株中的表達量，并測定其改變量。因此，我們可以分析檢測同一基因在受不同時間鹽脅迫植株中的表達量，確定預測基因與大豆耐鹽的相關性。（步驟同驗證候選基因）

采用合豐39大豆耐鹽閾值濃度，含50mmol/L NaCl的50%霍格蘭氏培養液，對水培大豆植株進行鹽脅迫，分別進行鹽脅迫0小時、3小時、12小時、24小時、3天、5天，共6組，每組5株。按照相應脅迫時間進行取樣 （取樣方法同1.3.2）。

使用康為RNApure Plant Kit提植物RNA，反轉錄為cDNA。（提取、反轉錄方法同步驟同驗證候選基因）PCR退火溫度為57℃，40個循環，每組5個樣品，分別將模板中cDNA濃度稀釋1倍、10倍、100倍、1000倍、10000倍，加入SYBR Green熒光染料，平行進行實時熒光定量PCR擴增。

最終確定預測基因的表達式樣與大豆所受鹽脅迫的相關性。

2 結果與討論

2.1 大豆耐鹽基因的篩選結果

2.1.1 ORF預測結果 通過SoftBerry網站的相關軟件，我們以大豆基因組中1167011bp的DNA序列為基礎。預測了ORF共211個，其中113個位于正鏈，98個位于負鏈，平均長度1007bp；967個外顯子，平均長度220bp。

2.1.2 同源基因檢索結果 通過在NCBI雙子葉植物基因數據庫中進行BLAST檢索，211個預測基因中86個ORF沒有發現相似的序列，被淘汰；125個ORF與其它雙子葉植物基因有較強的相似性。根據已注釋的大豆及其它雙子葉植物基因的功能，從125個ORF中篩選出25個可能與大豆耐鹽相關的抗鹽候選基因。其功能涉及包括離子交換和調控基因表達等。

2.2 大豆耐鹽候選基因PCR驗證結果

2.2.1 合豐39大豆的耐鹽閾值測定結果

表1 第一周期耐鹽范圍測定的實驗結果

通過分析表1數據，鹽濃度在120mmol/L及以上的情況下，植株死亡過半，這種環境對于植株的脅迫作用相當明顯，極大抑制植株的生長。鹽濃度在60mmol/L及以上的情況下，植株的葉子生長情況較差，葉片普遍偏小且下垂、黃萎，這種環境對于植株生長有比較大的脅迫作用。20mmol/L組共有9株樣品，其中有一株從第一對真葉展開后生長明顯遲緩，而后逐漸黃萎，在培養兩周后枯萎，個體異常造成該組存活率異常。綜合以上結果，可以分析得到合豐39大豆的耐鹽極限大致在40mmol/L—60mmol/L NaCl。

表2 第二周期耐鹽范圍測定的實驗結果

通過表2我們可以看出，當鹽濃度超過50mmol/L后，第一片真葉黃萎、枯死明顯，第二片真葉雖都存活，但植株葉與根的生長都受到一定影響。經過第二周期實驗，合豐39型大豆的耐鹽閾值可以確定在50-55mmol/L NaCl。

2.2.2 候選基因PCR驗證結果

通 過 瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳 實 驗 ，ORF20、ORF31、ORF33、ORF42、ORF62、ORF63和ORF79，都沒有明顯可見條帶，很有可能是不直接響應于大豆鹽脅迫，遂將其排除；其它基因都基本正常擴增，證實它們在植株中能夠正常表達，確定候選基因13個。

2.3 實時熒光定量PCR結果

實驗一共進行了兩組，第一組將13個精篩后的候選基因和Tube、AS，共15個樣品進行實驗操作，繪制擴增曲線，分析DNA溶解溫度，最終確定10個候選基因，）進行第二組定量PCR擴增，精確測定表達量。

實驗數據采用2-ΔΔCt法處理，即以基因在每組脅迫0小時植株的根中的表達量為標準量1，計算相對表達量。實驗結果按根中的表達量可分為3種：

（1）單調增加。ORF179和ORF202在根中的表達量都是隨鹽脅迫時間成線性上升，說明該基因的表達是與植株耐鹽性狀正向相關的。如ORF179是PHD finger蛋白家族相關基因，參與到染色體狀態的調控和基因的轉錄調控等[9]，該基因在鹽脅迫下的表達量增加，很可能是植株克服逆境的重要機制。

（2）先增高后降低。這些基因可能是植株的某種應急機制。在受到鹽脅迫時，植株立即響應，提高某些基因的表達，對抗不利環境，隨后在其它基因的陸續作用，或外界不利條件加劇的影響下，基因表達量再降低。如ORF160是亮氨酸拉鏈相關基因，是植物基因調控的重要因子，其在根中表達量上升又下降，很可能是受其他基因的影響，在短時的高表達之后，作用漸漸被其他基因所取代。

（3）單調下降。對于鹽脅迫時間長而表達量單調下降的基因而言，是與鹽脅迫反向相關。這樣的基因可能是受到鹽脅迫，表達被抑制。

圖1 實時熒光定量PCR

3 結論

實時熒光定量PCR的結果顯示，ORF179和ORF202是與大豆所受鹽脅迫成正相關的。說明其不僅響應于大豆植株所受的鹽脅迫，還很有可能調控大豆其它相關基因的表達以對抗高鹽濃度對植株造成的損害。

ORF123等基因在根中的表達量都呈現先增高，后降低的過程。如ORF123，基因功能可能是Na+/H+逆向運輸蛋白相關的基因，能降低胞質Na+濃度，減輕Na+對酶類和膜系統的傷害，但之后其表達量又有所下降，推測是因為隨著鹽脅迫時間的增長，鹽溶液對植株的毒害作用逐漸增大，對其表達產生了影響；而其它基因功能可能為轉錄因子，其先增高后降低的趨勢，可能是一種預警或應激機制，與耐鹽性狀并非直接相關。

ORF61在根中的表達量隨著鹽脅迫時間的增長而下降，屬于與鹽脅迫反向相關。

綜上所述，與鹽脅迫正向相關的基因ORF179 PHD finger transcription factor-like protein，位于大豆基因負鏈上；ORF202 ccaat-binding transcription factor subunit A，位于大豆基因正鏈上，是兩個調控基因。預測基因功能與離子轉運有關的基因ORF123 Na+/H+antiporter-like protein，位于大豆基因正鏈上，是結構基因。根據多步實驗的逐級驗證，這三個基因在大豆植株中與其耐鹽性狀相關。

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[責任編輯：錢立武]

Q344

A

1674-1104(2014)03-0158-03

10.13420/j.cnki.jczu.2014.03.050

2014-03-14

原野（1992-），男，山西黎城人，復旦大學生命科學學院學生，研究方向為植物生理及生物進化。