優(yōu)化米曲霉固體發(fā)酵生產(chǎn)輔酶Q10的研究

李 豪

(1.馬鞍山師范高等專科學(xué)校，安徽馬鞍山243041;2.西華大學(xué)生物工程學(xué)院，四川成都610039)

輔酶Q10［1］簡寫為CoQ10，又稱泛醌或癸烯醌，它的化學(xué)結(jié)構(gòu)為6位碳上連有一個10單位異戊二烯側(cè)鏈的2，3－二甲氧基－5－甲基－1，4－苯醌衍生物，具體見圖1［2］.輔酶Q10是一種脂溶性天然維生素類物質(zhì)，在生物體內(nèi)起遞氫體的作用［3］，輔酶Q10是細胞代謝激活劑和天然抗氧化劑，能抑制線粒體的過氧化，在心血管疾病的治療中發(fā)揮著重要作用，可以提高人體免疫力，廣泛運用于保健和治療領(lǐng)域［2－4］.其作為醫(yī)藥、食品添加劑已被應(yīng)用，但由于產(chǎn)量低，輔酶Ql0不僅在國際市場上供不應(yīng)求，在國內(nèi)的市場缺口也很大.對輔酶Q10的生產(chǎn)技術(shù)進行研究改進就非常必要.

米曲霉(Aspergillus oryzae)一種真菌，絲孢綱，絲孢目，從梗孢科，米曲霉是異養(yǎng)需氧微生物，輔酶Q10是呼吸鏈上的重要物質(zhì)，米曲霉細胞內(nèi)也應(yīng)該存在輔酶Q10，基于此本項目探索利用米曲霉生產(chǎn)輔酶Q10.

對CoQ10的微生物發(fā)酵生產(chǎn)以液體培養(yǎng)方法為主，與液態(tài)培養(yǎng)相比固態(tài)培養(yǎng)具有生產(chǎn)本低、操作簡便等優(yōu)點，因此本試驗選用價格較為低廉的農(nóng)副產(chǎn)品大豆、麥麩和谷糠為原料，對米曲霉進行固態(tài)發(fā)酵研究.微生物發(fā)酵法對菌種、發(fā)酵條件等技術(shù)要求較高，要使高產(chǎn)菌株的高產(chǎn)性能充分表現(xiàn)，必須保證菌體生長及產(chǎn)物生成所必需的最佳條件［5］.本研究應(yīng)用配方均勻設(shè)計和正交設(shè)計分別對固體培養(yǎng)主要成分以及固體培養(yǎng)條件進行系統(tǒng)優(yōu)化分析，使米曲霉固體發(fā)酵生產(chǎn)輔酶Q10的后續(xù)研究及規(guī)模化發(fā)酵生產(chǎn)提供依據(jù).

圖1 輔酶Q10分子結(jié)構(gòu)圖Fig.1 The structure of the coenzyme Q10 molecule

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米曲霉(Aspergillus oryzae)2077，購于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心;大豆，水分11%，購于馬鞍山市安民農(nóng)副產(chǎn)品交易市場;斜面培養(yǎng)基馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)，0.1 MPa滅菌30 min;麩皮培養(yǎng)基:麩皮90 g，水100 mL，自然pH值，適量裝入500 mL三角瓶中，121℃滅菌30 min，溫度降低至室溫搖散備用.

標準樣品:輔酶Q10標準品購買自Sigma;青霉素鈉，石藥集團河北中潤制藥有限公司生產(chǎn)，配制成100 U/mL的青霉素鈉溶液后使用;石油醚、無水乙醇等試劑化學(xué)藥品均為國產(chǎn)分析純.

UV759型紫外－可見分光光度計:上海精密科學(xué)儀器有限公司制造;恒溫培養(yǎng)箱DNP－9022－1A，上海三發(fā)儀器有限公司制造.

1.2 試驗方法

1.2.1 孢子懸浮液制米曲霉孢子懸浮液制備

首先將米曲霉PDA斜面培養(yǎng)基上活化，然后分別挑取活化好的菌絲接種到裝有麩皮培養(yǎng)基的三角瓶上進行擴大培養(yǎng)，活化和擴大培養(yǎng)條件均為溫度30℃、時間3 d，向三角瓶加入適量的質(zhì)量分數(shù)為0.9%生理鹽水，振蕩后，用無菌紗布過濾，濾液用0.9%的生理鹽水稀釋，制成1×107～5×107個/mL的孢子懸浮液備.

1.2.2 固體培養(yǎng)與輔酶Q10檢測

發(fā)酵培養(yǎng):在500 mL三角瓶中加入100 g設(shè)計好的培養(yǎng)基，加入一定比例水后，攪拌均勻后于121℃殺菌30 min，冷卻至室溫，按每瓶固體培養(yǎng)基5 mL孢子懸液接種，攪拌均勻后，于35℃培養(yǎng)48 h后，加入一定時間后加入一定體積100 U/mL的青霉素鈉溶液，混合均勻后繼續(xù)培養(yǎng)一定時間，按照王根華等［6］研究的輔酶Q10的提取及測定方法進行檢測.

2 結(jié)果與討論

2.1 培養(yǎng)基配方優(yōu)化設(shè)計

選取了大豆、麥麩和谷糠為培養(yǎng)基的主要成分，其含量分別記作x1、x2和x3，進行配方均勻設(shè)計［7］，選取UM15(153)表安排試驗.三種成分含量之和為1，在表1中只列出了x1和x2，則x3=1－x1－x2.研究方案和結(jié)果y(越大越好)見表1，指標y為輔酶Q10的產(chǎn)量，單位是mg·g－1干培養(yǎng)基.

表1 均勻配方設(shè)計方案與試驗結(jié)果表Table 1 Formula experiment results by Uniform design

應(yīng)用Excel軟件進行回歸分析得二元二次方程為:

y=0.093+1.269x1+1.552x2 －1.706x1x2 －1.131x1x1 －1.111x2x2

復(fù)相關(guān)系數(shù)為0.96，回歸效果的方差分析見表2.

表2 回歸效果的方差分析Tab.2 The analysis of variance table of the regression effect

由復(fù)相關(guān)系數(shù)和方差分析研究的結(jié)果表明所建立的回歸方程非常顯著，該數(shù)學(xué)模型能夠很好的反映配方中成分含量對指標輔酶Q10產(chǎn)量的影響.由于輔酶Q10產(chǎn)量的影響越大越好，運用Excel軟件，得到y(tǒng)最大值為0.638，培養(yǎng)基的最優(yōu)配方為x1=8.20%，x2=63.53%和 x3=28.27%，即大豆8.20%、麥麩63.53%和谷糠28.27%.回歸方程所得配方與第12號實驗配方非常接近，并且回歸值與實驗值也非常接近，說明所得最優(yōu)配方可行可靠，能夠進行實際應(yīng)用.

2.2 固體發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1 因素水平的確定

在確定培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上對固體發(fā)酵條件進行優(yōu)化，由于CoQ10是胞內(nèi)產(chǎn)物，通過改變細胞壁或細胞膜的結(jié)構(gòu)可以增大胞內(nèi)物質(zhì)的溶解速率和細胞壁的通透性［8］，進而提高其產(chǎn)量.本研究基于此嘗試在固體培養(yǎng)中加入適量青霉素鈉，探索其對CoQ10產(chǎn)量的影響.在預(yù)試驗的基礎(chǔ)上，確定了青霉素鈉加入量、發(fā)酵溫度、料水比和發(fā)酵時間為發(fā)酵過程中要重點考慮的四個因素進行正設(shè)計法優(yōu)化發(fā)酵工藝.具體因素水平見表3.

表3 正交實驗水平因素表Tab.3 Orthogonal experimental factors and levels

2.2.2 固體發(fā)酵影響因素正交實驗結(jié)果直觀分析

按照表3因素水平數(shù)據(jù)，選取L9(34)正交表設(shè)計試驗方案，得到試驗結(jié)果，并進行直觀分析，見表4.

表4 L9(34)正交設(shè)計方案及試驗結(jié)果直觀分析Tab.4 L9(34)orthogonal test result and visual analysis of table

由表4數(shù)據(jù)直觀分析可知，因素對發(fā)酵結(jié)果的影響大小為C﹥A﹥B﹥D，結(jié)合正交設(shè)計得到的因素與指標關(guān)系趨勢圖

圖2，可得優(yōu)方案為C2A1B2D2，即料水比為1、青霉素鈉加入量為3 mL、發(fā)酵溫度40℃、發(fā)酵時間96 h為較優(yōu)固體培養(yǎng)條件.按照2.1所優(yōu)化的培養(yǎng)基和該固體較優(yōu)發(fā)酵條件下，CoQ10的產(chǎn)量三次平均值為0.947/mg·g－1干培養(yǎng)基.

圖2 因素與指標關(guān)系圖Fig.2 the Relationship between Factors and Indicator

3 結(jié)論

利用配方均勻設(shè)計方法成功獲得固體培養(yǎng)基主要成分的較優(yōu)比例，表明配方均勻設(shè)計方法是確定培養(yǎng)基配方的高效快速方法，其高效快速性主要體現(xiàn)在不需要做單因素試驗，而且方案中的各試驗可同時平行進行，節(jié)約了時間，該方法可以作為優(yōu)化培養(yǎng)基配方的高效快速方法.

本實驗發(fā)酵過程分為兩個過程，第一個階段是菌種在適應(yīng)的條件下快速生長繁殖，達到較高濃度的菌體量，發(fā)酵時間為48 h，第二階段是加入一定量的青霉素鈉的后發(fā)酵階段，該階段菌體的生長受到抑制，在青霉素鈉的作用下，細胞膜通透性增加，有利于胞內(nèi)物向胞外擴散，從而誘導(dǎo)CoQ10的生產(chǎn)，第二階段是產(chǎn)CoQ10的主要階段.

以CoQ10的產(chǎn)量為指標，優(yōu)化后的固體培養(yǎng)基主要成分百分比為大豆8.20%、麥麩63.53%和谷糠28.27%.應(yīng)用正交設(shè)計確定100 g培養(yǎng)基固體的較優(yōu)培養(yǎng)條件為:料水比為1、青霉素鈉加入量為3 mL、發(fā)酵溫度40℃、發(fā)酵時間96 h.通過對培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化得到米曲霉2077產(chǎn)輔酶Q10的最大值為0.947/mg·g－1干培養(yǎng)基.本結(jié)果與白娟［9］利用總狀毛霉生產(chǎn)固體發(fā)酵所得輔酶Q10產(chǎn)量0.65299/mg·g－1干培養(yǎng)基有所提高.

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