凝膠過濾色譜純化乳清蛋白降膽固醇肽的研究

馬麗媛，李曉東c，莊建鵬，尚爾坤，任紅晶，李明浩，劉璐，畢偉偉

(東北農業大學 a.乳品科學教育部重點實驗室；b.食品學院，c.食品安全與營養協同創新中心；哈爾濱 150030)

0 引 言

干酪副產物乳清營養價值獨特，其主要成分乳清蛋白已被證實含有很多潛在的生物活性肽段，這些生物活性肽在原乳清蛋白序列中并無活性，一般通過胃腸道時釋放出來的很少，但在體外可通過酶解及分離純化技術將其釋放出來，包括具有抗高血壓、降膽固醇、抑菌、抗氧化等功能的活性肽[1,2]。Nagaoka,S通過小鼠生物實驗證明，相比大豆蛋白和酪蛋白，牛乳清蛋白源生物活性肽具有更強的降低血液膽固醇的活性[3]。

凝膠過濾色譜是很好的分離純化肽的方法，它是利用具有網狀結構的凝膠分子篩，將不同分子大小的物質分離開來，是一種液體柱層析技術[4,5]。凝膠過濾色譜不僅能將肽分離純化，還可以分析肽的相對分子質量，其分離分析簡單快速而被廣泛應用。

1 實 驗

1.1 材料

乳清蛋白產品；蛋白質標準品(胰蛋白酶、溶菌酶、糜蛋白酶、牛胰島素、維生素B12)；凝膠葡聚糖Sephadex G-50。

1.2 設備

WIGGENS數字式攪拌器，SMB-20型超濾設備，TDL-500B冷凍離心機，LGJ-1型冷凍干燥機，KQ-500B型超聲波清洗器，玻璃層析柱1.5 cm×70 cm，?KTATMprime蛋白質純化系統。

1.3 方法

1.3.1 乳清蛋白水解肽的制備

取一定量的乳清蛋白配制成一定濃度的水溶液，置于恒溫水浴鍋中90℃高溫滅酶活10 min后，冷卻至酶解溫度，用濃度為1.0 mol/L的氫氧化鈉溶液調節酶解液pH值至適宜條件，加入一定量的胰蛋白酶，將數字攪拌器插入溶液中選擇一定轉速進行攪拌，水解過程中不斷加入適量氫氧化鈉溶液以維持pH值在適宜范圍內，水解結束時將水溫再次調至90℃高溫滅酶活10 min，4 000 g離心10 min，排除沉淀，上層清液使用10 ku截留薄膜超濾，收集超濾透過液，即為乳清蛋白水解液。冷凍干燥，-20℃保存備用。

1.3.2 凝膠色譜分離降膽固醇活性肽

1.3.2.1 凝膠前處理

將一定量凝膠葡聚糖Sephadex G-50溶于水后經沸水溶脹2 h，冷卻至室溫，真空抽濾去除氣體后裝柱。將1.5 cm×70 cm的玻璃層析柱垂直固定在蛋白純化儀的支架上，將預處理好的Sephadex G-50緩慢裝入層析柱中，先加入緩沖液，緩沖液體積占柱體積10%～15%為宜，后緩慢加入膠液，保證凝膠液面水平，打開出液口排出多余緩沖液，使柱內膠面上部保留2～3 cm緩沖液為宜。再將玻璃層析柱上兩端的的進出液管口分別與儀器上相應的進出液位置相連，打開機器，用3～5倍柱體積緩沖液沖洗機器和柱子，待機器紫外檢測值穩定后上樣。

1.3.2.2 繪制凝膠過濾色譜的分子量校正曲線

選擇幾種已知分子量的蛋白質標準品，由于凝膠葡聚糖Sephadex G-50分離的范圍是1 500～30 000 u，所以實驗選擇胰蛋白酶(MW 23.3 ku)、溶菌酶(MW 14.4 ku)、 糜蛋白酶 (MW 11.0 ku)、 牛胰島素(MW 5.73 ku)、維生素B12(MW 1.36 ku)，質量濃度為1.0 g/L，一次進樣6 mL(凝膠總體積的5%)，將標準品分別進行凝膠層析，記錄每個標準物質出現峰值的時間，以蛋白標品分子量的對數為縱坐標，出現峰值的洗脫時間為橫坐標繪制校正曲線。

1.3.2.3 凝膠過濾色譜純化乳清蛋白肽條件的優化

本實驗分別選擇磷酸鈉緩沖液、醋酸鈉緩沖液和Tris-HCl緩沖液3種溶液作為流動相，在其他條件一定的情況下對乳清蛋白肽進行分離純化，根據凝膠分離效果篩選合適的洗脫溶液，分別進行洗脫，并對篩選的洗脫液濃度和pH值進行優化，收集每個洗脫峰的組分，測定其降膽固醇活性。

取凍干后的水解肽，用一定濃度的緩沖液配制成質量濃度為20 g/L的溶液，通過進樣環進樣。調節壓力為1.0 MPa，流速為1 mL/min，樣品收集為2 mL/管，一次上樣6 mL(5%BV)，紫外檢測器波長為280 nm，收集各個洗脫峰，經冷凍干燥后備用。

1.3.3 降膽固醇活性的測定

Nagaoka S.等人研究發現，通過配制一種模擬人體胃腸道環境的人造膽汁膠束溶液，經超速冷凍離心使膠束溶液發生兩相分離，然后測定其水相中膽固醇溶出的含量，來考察乳清蛋白肽對膽固醇在膠束溶液中的溶解度的影響，進而成為衡量降膽固醇活性高低的指標。

參照Charles F.Shoemaker[6]等人的方法并略作修改，配制模擬膽汁膠束溶液包含：濃度為0.01 mol/L牛磺膽酸鈉，0.002 mol/L膽固醇，0.005 mol/L油酸，0.135 mol/L氯化鈉，0.015 mol/L磷酸鈉緩沖液(pH值為7.4)，質量濃度為5 g/L水解肽粉末，通過超聲波乳化制得，然后37℃培養24 h，100 000 g離心60 min后取上清液測定膽固醇濃度。上清液中的膽固醇濃度即為膽固醇膠束溶解度，以不加水解肽的膠束溶液為空白，按下式計算水解肽對膽固醇在模擬膽汁膠束溶液中的溶解度的抑制率為

抑制率=(M-N)/M×100%

式中：M為空白對照溶液的膽固醇溶解度(mol/L)；N為樣品溶液的膽固醇溶解度(mol/L)。

2 結果與討論

2.1 分子量校正曲線的繪制

將已知分子量蛋白質標準品分別進行凝膠層析，研究蛋白質分子量對數與其出峰時間的關系，如圖1所示。

圖1 蛋白標品分子量對數與出峰時間的關系

由圖1可以看出，蛋白標品分子量的對數和出峰時間之間存在明顯的線性關系，得到回歸方程：y=-0.014x+4.5203(R2=0.9785)，根據這個回歸方程可以粗略計算樣品中多肽的分子量分布。

2.2 凝膠過濾色譜純化乳清降膽固醇肽分離條件的篩選

為得到好的分離效果，在流速1 mL/min、壓力1.0 MPa、凝膠體積120 mL等其他條件一致的情況下，比較了相同濃度和pH值的3種洗脫流動相對乳清蛋白降膽固醇肽的分離情況，同時對篩選的洗脫液濃度和pH值進行優化。

2.2.1 洗脫流動相種類篩選

圖2為pH 值為7.0，濃度為0.05 mol/L洗脫流動相種類篩選結果。由圖2可以看出，以Tris-HCl和醋酸鈉溶液作為流動相洗脫時，只出現了兩個明顯的洗脫峰，而相同條件的磷酸鈉溶液作為流動相時洗脫得到了3個明顯的洗脫峰，分離效果較好。所以選擇磷酸鈉溶液作為流動相進行后續的實驗。

圖2 相同pH值和濃度下各洗脫流動相種類篩選結果

2.2.2 pH值篩選

在其他條件一致的情況下，考察了不同pH值的磷酸鈉緩沖液對乳清蛋白降膽固醇肽的分離情況，結果如圖3所示。

圖3 相同濃度不同pH值下洗脫液pH值篩選結果

由圖3可以看出，當pH值為6.0時，洗脫的第2個峰與第1個峰沒有完全分開，兩峰有粘連現象；當pH值為7.0時，雖然前兩個峰明顯分開，但是第3個峰峰型不完整，沒有很好的洗脫出來；當pH值為8.0時，可以明顯的看到三個界限較清晰地組分峰，此pH值下的分離效果較好。

2.2.3 洗脫液濃度篩選

在其他條件一致的情況下，選擇pH值為8.0的不同濃度的磷酸鈉緩沖液對乳清蛋白降膽固醇肽進行分離，篩選最佳流動相濃度，結果如圖4所示。

由圖4可以看出，隨著洗脫流動相的濃度增大，分離效果呈現越來越差的現象。可能是由于離子強度過大，待分離肽與凝膠之間結合力較小，峰與峰之間出現粘連、甚至拖尾現象。而當磷酸鹽洗脫液的濃度為0.03 mol/L時，待分離肽被分成3個明顯的組分峰，且峰型較窄，無拖尾現象，顯示分離效果較好。

綜上所述，當選擇pH值為8.0，濃度為0.03 mol/L的磷酸鈉溶液作為洗脫流動相，在280 nm檢測波長下測定各個管中的吸光值，組分的凝膠層析圖共出現3個比較明顯的峰，3個洗脫組分峰得到了較好的分離，與其他分離條件相比較分離效果較好。所以本實驗選擇pH值為8.0，濃度為0.03 mol/L的磷酸鈉溶液進行實驗，將洗脫下來的3個峰的液體收集，重復多次上樣，真空濃縮，冷凍干燥，分別測定它們的降膽固醇活性。

2.3 目標活性肽的降膽固醇活性及分子量分布

水解肽經凝膠葡聚糖Sephadex G-50分離得到的3個組分峰(圖4a)分別命名為：F1，F2，F3，經真空濃縮，冷凍干燥，測定的膽固醇膠束溶解度抑制率結果如表1所示。

圖4 不同濃度下的洗脫液液濃度的篩選結果

由表1可以看出，經Sephadex G-50凝膠層析分離前后水解肽的膽固醇膠束溶解度抑制率差異顯著，且第1、2、3洗脫組分的降膽固醇活性差異顯著，洗脫組分F2的膽固醇膠束溶解度抑制率最高為57.48%，可以確定F2組分即為目標活性肽，即降膽固醇肽。根據凝膠分子量校正曲線計算可知降膽固醇肽的分子量在2 000～4 700 u范圍內。

表1 3個組分的膽固醇膠束溶解度抑制率和分子量分布

3 結 論

本文研究了凝膠過濾色譜分離純化乳清蛋白降膽固醇肽的洗脫條件，確定的最佳洗脫流動相為pH值為8.0，濃度為0.03 mol/L的磷酸鈉溶液。在此條件下，乳清蛋白降膽固醇肽經凝膠葡聚糖Sephadex G-50分離純化后，膽固醇膠束溶解度抑制活性從24.18%提高到至57.48%，分子量分布在2 000～4 700 u范圍內。研究結果表明，采用凝膠過濾色譜法純化乳清蛋白降膽固醇肽是完全可行的，在提高活性肽生物活性的同時，還可以對活性肽的相對分子質量分布進行分析。但是經凝膠過濾色譜純化后的乳清蛋白降膽固醇肽還不是單一組分，在下一步的工作中，將運用反相高效液相色譜對其進一步純化。

[1]包怡紅，李銳達.乳清多肽的分離純化及體外抗氧化活性研究[J].中國乳品工業，2011，39(10)：12-14.

[2]劉玉軍，魏永利，代龍.肽的分離純化研究進展[J].遼寧中醫雜志，2012，39(1)：180-181.

[3]NAGAOKA S,KANAMARU Y,FUTAMURA Y,et al.Identification of novel hypocholesterolemic peptides derived from bovine milk β-lactoglobulin[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2001,281(1):11-17.

[4]于志鵬，趙文竹，劉靜波，等.蛋清蛋白質降壓肽純化及分子量測定[J].食品工業科技，2010，31(7)：230-232.

[5]PAN D D,CAO J X,GUO H Q,et al.Studies on Purification and the Molecular Mechanism of a Novel ACE Inhibitory Peptide from Whey Protein Hydrolysate[J].Food Chemistry,130(2012)121-126.

[6]ZHONG F,MA J G,CHARLES F S,et al.Preparation of Hypocholesterol Peptides from Soy Protein and their Hypocholesterolemic Effect in Mice[J].Food Research International,40(2007)661-667.