胰蛋白酶水解制備胰酪胨的工藝條件研究

齊奇，劉河濤，楊文君，王銀，余建強

(寧夏醫科大學 a.基礎醫學院；b.藥學院，銀川 750004)

0 引 言

牛乳中含有大量的蛋白質,其質量分數約為牛乳的3.3%～3.5%。主要有酪蛋白、乳白蛋白、乳球蛋白、乳鐵蛋白和一些具有重要生理功能的酶類,其中酪蛋白占78.8%，酪蛋白經酶促水解后可以產生相應的產物——胰酪胨[1]。胰酪胨，又稱胰酪蛋白胨(Casein Tryptone)、胰酶消化酪蛋白胨(Pancreatic digest of casein)，是一種優質蛋白胨，含有豐富的氮源、氨基酸等，是微生物培養基關鍵原材料之一，能用于任何需要酪蛋白的胰酶或胰蛋白酶水解產物的配方之中，用于細菌的培養、分離、增殖、鑒定，以及無菌試驗培養基、厭氧菌培養基等細菌生化特性試驗用培養基的配置。特別是由于富含色氨酸可用于吲哚試驗培養基和營養要求較高的生物培養基[2-3]。

本研究中采用當地所生產鮮牛奶經過等電點沉淀、洗滌、脫脂和凍干后生產的酪蛋白作為反應底物，經過胰蛋白酶水解后得到胰酪胨。分別研究pH值、反應時間、水解溫度和酶與底物的濃度比對胰蛋白酶水解效率的影響，通過L9(34)正交表排列優化提取工藝參數，以期達到提高酪蛋白原料的利用率。同時亦獲得成本較低、水解度高、氨基酸及其他各項理化性質達標的胰酪胨產品。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮牛奶，胰蛋白酶，酪蛋白，胰酪胨標準品，BCA蛋白濃度測定試劑盒。

1.2 儀器與設備

TU1810型紫外可見分光光度儀，L-8800型氨基酸分析儀，PowerDry LL3000凍干機，AnkeTDL-S-A臺式離心機，DK-s24恒溫水浴箱，Z-2000原子吸收光譜儀。

1.3 方法

1.3.1 酪蛋白的制備

(1)酪蛋白制備工藝流程

新鮮牛奶→等電點沉淀蛋白→離心洗滌(15 min，3 000 r/min)→抽濾洗滌→乙醚、乙醇脫脂→凍干

(2)酪蛋白制備工藝的參數確定[4-7]。為確定等電點法制備胰酪胨的最佳工藝條件，以100 mL經巴氏消毒后的鮮牛奶為原材料設計單因素試驗進行制備。固定其他條件，分別考察提取溫度(40，45，50，55，60 ℃)，pH值(4.3，4.5，4.7，4.9，5.1)對提取效果的影響。

(3)酪蛋白純度采用雙縮脲法測定。

1.3.2 胰酪胨的制備

1.3.2.1 胰酪胨制備工藝流程[8-11]

酪蛋白→加水后加熱90℃保持30 min→調節pH，溫度后加入胰蛋白酶→保持pH值，溫度消化2 h→加入胰蛋白酶，保持pH值溫度酶解1 h→加入胰蛋白酶，保持pH值溫度酶解1 h→加入冰醋酸，同時加入活性炭，95℃以上攪拌15 min→過濾后干燥→胰酪胨

1.3.2.2 胰酪胨制備工藝要點[12-17]

為確定胰蛋白酶水解制備胰酪胨最佳工藝條件，根據胰蛋白酶水解工藝設計試驗因素和水平，以水解度和氨基氮為考察指標，對水解溫度、水解pH值、水解時間以及酶濃度和底物濃度比(E/S)，進行L9(34)正交實驗，結果如表1所示。

表1 正交實驗因素水平

1.3.3 理化性質檢測方法[18-19]

為確定根據以上工藝條件制備出的胰酪胨完全符合市售胰酪胨產品理化指標要求，分別對其各項理化性質進行了檢測。

(1)水解度(DH)的測定水解度采用pH-STAT法。

(2)氨基氮測定采用甲醛滴定法。

氨基氨質量分數＝滴定用標準堿毫升數×堿濃度×1.4／樣品質量。

(3)總脂、水分、灰分和總氮的測定方法參照國家標 準 GB/T5009.5-2003，GB/T5009.10-2003，GB/T5009.3-2003，GB/T5009.4-2003中進行。

(4)氨基酸的測定方法采用國家標準GB/T18246-2000進行。

(5)胰酪胨所含蛋白質濃度檢測采用BCA法測定。

(6)微量元素測定采用原子吸收法。

2 結果與分析

2.1 酪蛋白制備單因素試驗

2.1.1 pH值對酪蛋白制備結果的影響

將100 mL經過巴氏消毒后的鮮牛奶預熱至45℃時， 分別加入pH值為4.3，4.5，4.7，4.9和5.1的濃度為0.2 mol/L的醋酸——醋酸鈉緩沖液中沉淀10 min，后經過排除乳清、水洗滌、脫脂和烘干得出酪蛋白，并檢測酪蛋白產率和酪蛋白純度。

由圖1可以看出，在溫度和提取時間固定的情況下，當pH值在4.7時，酪蛋白的產量最高，而不同pH值下提取的酪蛋白純度相差不大。

圖1 pH值對酪蛋白制備結果的影響

2.1.2 溫度對酪蛋白制備結果的影響

將100 mL經過巴氏消毒后的鮮牛奶分別預熱至40，45，50，55 ℃和60 ℃時， 分別加入pH值為4.7濃度為0.2 mol/L的醋酸——醋酸鈉緩沖液中沉淀10 min，后經過排除乳清、水洗滌、脫脂和烘干得出酪蛋白，并檢測酪蛋白產率和酪蛋白純度。

圖2 溫度對酪蛋白制備結果的影響

由圖2可以看出，在pH值和提取時間固定的情況下，當溫度在40℃時，酪蛋白的產量最高，而不同pH值下提取的酪蛋白純度相差不大。

2.2 胰蛋白酶水解制備胰酪胨工藝正交實驗2.2.1 以水解度為指標進行正交實驗[20-21]

以水解度為指標，進行L9(34)正交實驗，結果如表2所示。

表2 胰蛋白酶水解正交試驗設計與結果

由表2可得出，以水解度為指標，胰蛋白酶水解酪蛋白最佳條件為A2B2C3D1，即pH值為8.0，溫度50℃，水解時間2.5h，E/S為0.24，此時水解度達44.4%。根據極差分析各因素的影響順序為pH值＞酶解溫度＞酶解時間＞E/S。

2.2.2 以氨基氮為指標進行正交實驗

以水解度為指標，進行L9(34)正交實驗，結果如表3所示。

表3 胰蛋白酶水解正交試驗設計與結果

以氨基氮為指標，表示的是制備出的胰酪胨中所含的在微生物生長初期可以被快速利用的營養成分含量，培養基中氨基氮的含量直接決定了培養基中能被微生物吸收的氮源含量。由表3可以看出，處于A1B1C3D3，即pH值為8.0，溫度40 ℃，水解時間1.5 h，E/S為0.32，此時氨基氮質量分數最高，達到4.5%。根據極差分析得出各因素的影響順序為pH值＞酶解溫度＞E/S＞酶解時間。

2.2.3 驗證試驗結果

以水解度為指標，得出制備胰酪胨的最佳條件為A2B2C3D1；以產物中氨基氮為指標，得出的制備最佳條件為A1B1C3D3。分別對工藝組合A2B2C3D1和A1B1C3D3進行三次平行試驗，確定胰蛋白酶水解酪蛋白的最佳條件。在工藝組合A2B2C3D1中，平均水解度為43.68%，氨基氮為4.47%；而在工藝組合A1B1C3D3中，平均水解度為41.79%，氨基氮為4.52%。因此確定胰蛋白酶水解酪蛋白制備胰酪胨的最佳工藝條件為A2B2C3D1，即pH值為 8.0，溫度50℃，水解時間2.5 h，E/S為0.24。

2.3 胰酪胨理化性質檢測結果

參照國內蛋白胨質量標準和國外OXOID有關蛋白胨質量指標，將根據工藝條件A2B2C3D1制備出的胰酪胨進行理化指標的分析檢測，結果如圖3所示。

由圖3可以看出，經過以上工藝流程制備出的胰酪胨與OXOID生產的標準品相比，各項理化指標接近。實驗制備的胰酪胨經過檢測，總氮量與酪蛋白純度有關，實驗測得數據和標準相近。因此在制備胰酪胨時，酪蛋白選擇很重要。總磷、總脂、灰分的測定結果都小于標準品，其中總脂小于標準品是因為我們給樣品采用了脫脂的實驗操作，從而優化了胰酪胨的理化性質。

圖3 各項理化性質與標準品比較結果

2.4 微量元素檢測結果

為了確定制備出的胰酪胨符合微生物實驗所需，實驗測定了實驗測定了胰酪胨的微量元素項目，并且提供國外OXOID標準品的詳細參數，將制備的胰酪胨與標準品進行比較，結果如表4所示。

表4 微量元素分析 μg/g

通過表4可以看出，實驗制備出的胰酪胨各項微量元素水平除Ca以外，都和標準品相差不大，尤其是重金屬元素的水平還略低于標準品。Ca質量分數偏高是因為本地區的水質偏硬，所含Ca偏高。

2.4 氨基酸檢測結果

氨基酸是蛋白胨中的主要成分之一，也是細胞生長過程中的重要營養成分。對所制備的胰酪胨進行氨基酸分析，結果如表5所示。由表5可以看出，該蛋白胨中的必需氨基酸種類齊全且質量分數高，因此自制胰酪胨產品具有較高的營養價值。

表5 氨基酸組分分析 %

3 討 論

胰酪胨作為培養基關鍵原材料之一，其制備工藝以及制備出產品的質量直接影響微生物實驗的結果。目前國內生產胰酪胨的廠家參差不齊，生產出的胰酪胨產品質量也無具體檢測標準。培養基是醫學衛生研究、醫藥工業生產、臨床細菌檢驗、流行病學調查和生物制品制造等的重要基礎。胰酪胨作為培養基關鍵原材料，其質量好壞直接決定了微生物檢驗和生物產品的產量和質量。目前國內對胰酪胨制備工藝的研究較少，尤其是對制備出的胰酪胨無一套完整的質量控制標準，各項理化性質檢測手段也比較單一。

本研究中首先通過進行單因素試驗確定了制備酪蛋白的最佳條件，即pH值為 4.7，溫度40℃時酪蛋白產量最高。再通過分別以水解度和氨基氮為指標進行的L9(34)正交試驗確定胰蛋白酶水解酪蛋白制備胰酪胨的最佳水解參數，即pH 8.0，溫度55℃，時間2.5h，E/S為0.24，此時水解度達44.4%。按照此工藝條件制備出的胰酪胨通過各種檢測方法，將其各項理化指標與國外同類型產品比較，差異不大，滿足胰酪胨產品的規格要求，符合微生物實驗所需。進行微量元素測定也證明實驗制備出的胰酪胨各項微量元素水平與標準品接近，尤其是對微生物培養有害的重金屬元素含量極低。對所制得的胰酪胨進行氨基酸分析，其氨基酸組成豐富，微生物生長所需的谷氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸等氨基酸質量分數較高，其他必需氨基酸種類齊全且豐富可為微生物的生長提供豐富的營養。本實驗所優化出的胰酪胨制備工藝條件可為今后進行大規模高質量胰酪胨生產奠定了基礎，有著良好的經濟效益和較好的產業化前景。

[1]李曉輝.牛乳中酪蛋白的結構特性及其應用[J].食品工業，2002，(1)：29-31.

[2]石丹，王彩云，云戰友，等.風味酶水解乳清蛋白生產蛋白胨的工藝條件[J].中國乳品工業，2011，39(10)：208-211.

[3]高海燕，石丹，王彩云，等.利用復合酶技術制備乳清蛋白胨的工藝研究[J].中國食品學報，2013，13(2)：97-100.

[4]韓珍瓊，方建華.實驗室制備牛奶酪蛋白的技術研究[J].畜牧與飼料科學，2010，31(8)： 83-85.

[5]侯永新.酸法生產干酪素主要工藝條件優化的研究[J].食品工業科技，2005，(10)：138-140.

[6]程濤，孫艷波.雙縮脲法測定乳中酪蛋白含量[J].中國乳品工業，2000，28(3)：34-36.

[7]李宏梁，焦茜楠，黃峻榕等.酪蛋白沉淀檢測方法及其在牛乳經濟摻假鑒定中的應用[J].食品科技，2008(12)：262-267.

[8]SIND AYIKENGERA SéVERIN，XIA WEN-SHUI.Nutritional evaluation of caseins and whey proteins and their hydrolysates from protamex[J].ZheJiang Univ Science，2006，(7)：90-98.

[9]高長永，于鵬，張蘭威等.酪蛋白水解方法及水解產物功能性的研究進展[J].中國乳品工業，2011，39(10)：38-40.

[10]呂桂善，周文紅，姜瞻梅，等.酪蛋白水解進程的研究[J].食品工業科技，2003，24(8)：24-27.

[11]I SODINI，A LUCAS，J P TISSIER，et al.Physicalproperties and microstructure of yoghurts supplemented with milk protein hydrolysates[J].International Dairy Journal，2005(15)：29-35.

[12]DE SPIEGELEER P，SERMON J，LIETAERT A，et al.Source of tryptone in growth medium affects oxidative stress resistance in Escherichia coli[J].Appl Microbiol，2004，97(1)：124-33.

[13]OH S，RHEEM S，SIM J，et al.Optimizing conditions for the growth of Lactobacillus casei YIT 9018 in tryptone-yeast extract-glucose medium by using response surface methodology[J].Appl Environ Microbiol.1995，61(11)：3809-14.

[14]TURKI S，KRAEIM IB，WEECKERS F，et al.Isolation of bioactive peptides from tryptone that modulate lipase production in Yarrowia lipolytica[J].Bioresour Technol，2009，100(10)：2724-31.

[15]楊震，王愛霞，姬元忠，等.鹽酸快速水解酪蛋白工藝研究[J].食品研究與開發，2011，32(7)：44-47.

[16]劉亮亮.羊胰酶提取工藝及水解酪蛋白動力學研究[D].蘭州：甘肅農業大學，2010.

[17]王宗義，賈昌喜，韓濤，等.配合飼料基質中碘化酪蛋白水解條件的優化[J].北京農學院學報，2012，4(1)：16-18.

[18]趙新淮，馮志彪.蛋白質水解物水解度的測定[J].食品科學，1994，15(11)：65-67.

[19]王菊叢，賴陳潔.2010食品安全國家標準中大腸菌群計數方法的研究和探討[J].中國衛生檢驗雜志，2011，1(1)：116-117.

[20]王順民，鄭銳.正交試驗優化酶法提取菜籽皮不溶性膳食纖維工藝[J].食品科學，2013，34(8)：100-103.

[21]鐘源，肖文軍,馬蕊，等.正交試驗優化馬鈴薯龍葵素提取技術[J].食品科學，2013，34(10)：6-10.