十六烷基三甲基溴化銨強化產氫發酵

任云利，李 欣，張 柯，楊松波

(河南科技大學化工與制藥學院，河南洛陽471023)

0 引言

化石燃料是當今人類生產、生活的主要能源。隨著全球能量需求的增長，化石燃料等不可再生能源將日趨枯竭。氫能因具有可再生性和對環境友好的特性，成為最理想的能源載體之一。在各種產氫方法中，厭氧發酵制氫因其能耗低且可利用的底物廣泛，受到國內外學者的廣泛關注。通過優化發酵條件(如發酵溫度、pH和底物濃度等)實現產氫過程的強化已經做了大量的研究[1］。近幾年，一些研究者嘗試在培養基中添加微生物生長代謝所需要的微量化學物質(如金屬離子、煙酸、乳酸和L-半胱氨酸)實現強化發酵產氫[2-5］。

各種類型微生物的產氫過程都是氫酶催化的可逆的氧化還原反應。降低氫氣分壓，有利于可逆反應向著產氫方向進行。一些研究者通過降低發酵容器上空的氫氣分壓實現了累計產氫量的提高[6-7］。事實上，微生物細胞內所產生的氫氣首先要經過細胞膜釋放到培養基，然后再擴散至反應器的上空。而由細胞膜的流動性所形成的孔徑(不超過0.5～1.0 nm)僅僅略大于氫氣分子的空氣動力學直徑(0.3 nm)。因此，推測出提高微生物胞外膜的通透性，有可能從根本上降低胞內的氫氣分壓，從而促進產氫代謝。文獻[8］報道經表面活性劑處理過的紅酵母細胞或者重組大腸桿菌細胞能顯著提高胞外膜的通透性，最終有效提高反式肉桂酸的轉化率。文獻[9］研究得出將十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)加入產氣腸桿菌(一種高效產氫菌)整細胞的懸浮液中，胞內氫酶的活性可以得到檢測。因此，本文嘗試添加CTAB以提高產氫菌胞外膜的通透性，從而實現強化產氫的目的。

木糖是自然界中大量存在的植物纖維水解后的重要單糖之一。以木糖為碳源，研究混合菌發酵過程中CTAB對菌體胞外膜通透性、對細菌生長和對累計產氫量、產氫速率的影響。這種通過添加微量的表面活性劑以強化產氫的方法為將來厭氧發酵制氫的研究拓展了思路。

1 材料和方法

1.1 菌種和培養基

試驗用的混合菌取自洛陽市生生乳業牛糞沼氣發酵池。接種之前，混合菌先在100℃條件下處理

培養基組成:木糖10 g/L，蛋白凍5 g/L，磷酸二氫鉀14 g/L，磷酸氫二鉀6 g/L，硫酸銨2 g/L，檸檬酸鈉1 g/L，七水硫酸鎂0.2 g/L。

1.2 試驗方法

胞外膜通透性試驗:將37℃條件下厭氧培養24 h后的新鮮菌液離心、收集菌體，然后用100 mmol的磷酸鹽緩沖液(pH=7)洗滌、離心、重懸后得到OD600(600 nm波長下光密度)為3.31的菌體懸浮液。取4 mL菌體懸浮液和0.2 mL、0～1.2 g/L的CTAB溶液一并裝入7 mL的血清瓶，在37℃ 放置15 min、90 min或135 min。然后在8 944g條件下離心2 min，測上清液在280 nm下的吸光度(A280)。比較不同條件下A280值，分析從胞內釋放出蛋白的相對量，從而比較不同條件下胞外膜的通透性。

批式發酵試驗:在500 mL的發酵瓶中裝入100 mL的培養基、5mL濃度為0～1.0 g/L CTAB水溶液，然后接入5 mL熱處理過的混合菌菌液，用橡膠塞密封。向發酵瓶中鼓吹N210 min，以確保發酵的厭氧環境。將發酵瓶置于水浴搖床，在37℃轉速為150 r/min的條件下發酵，所產生的氣體經NaOH堿洗后用排水法收集[10］。

1.3 分析方法

氣相色譜檢測生物氣含量:Porapak Q不銹鋼填充柱，柱溫80℃，載氣為氮氣，流速為30 mL/min，進樣室溫度為80℃，檢測室熱導檢測器(TCD)，檢測室溫度120℃，橋電流120 mA。

1.4 產氫速率的計算

批式發酵的產氫過程可由Logistic模型[11］

進行描述，其中，H為t時刻的累計產氫量，mL;P為產氫過程的產氫潛能，mL;λ為產氫過程的停滯時間，h;Rm為最大產氫速率，mL/h。

2 結果和討論

2.1 CTAB對胞外膜通透性的影響

CTAB與細菌胞外膜的重要組成部分脂多糖的陽離子結合位點相互作用引起少量脂多糖的溶解，造成胞內的一些蛋白質和遺傳物質釋放到胞外。因此，CTAB可提高細胞膜的通透性。CTAB的濃度和對菌體的作用時間對上清液A280的影響見圖1。圖1底部的水平線表明不同濃度的 CTAB水溶液的A280相同，這意味著試驗條件下CTAB濃度的高低對溶液的A280值沒有影響。因此，一定濃度的CTAB與菌體作用后所得上清液的A280的變化與CTAB的濃度無關，而是單純由于胞內的一些蛋白質和遺傳物質釋放到胞外所引起的;不同CTAB濃度下所得上清液A280的大小表征了不同CTAB濃度下細胞膜的通透性的高低。

由圖1可看出:當CTAB的濃度小于0.004 8 g/L時，A280未見明顯變化;當CTAB的濃度大于0.009 5 g/L時，A280隨著CTAB濃度的增加而顯著增加。這表明當CTAB的濃度小于0.004 8 g/L時，CTAB對菌體胞外膜的通透性幾乎沒有影響;而當CTAB的濃度大于0.009 5 g/L時，細胞膜的通透性隨著CTAB濃度的提高而提高。濃度為0.057 0 g/L的CTAB與作用15 min后得到A280的值達到2.05，是0.009 5 g/L時的3倍以上，此時細胞膜的通透性嚴重提高。此外，在相同的CTAB濃度下，CTAB和菌體作用時間由15 min延長至90 min或135 min，A280未見顯著提高，這暗示CTAB對菌體胞外膜通透性的改變在15 min內已經完成。

圖1 CTAB的濃度和對菌體的作用時間對上清液A280的影響

2.2 CTAB對菌體生長和產酸代謝的影響

不同濃度的CTAB對發酵過程中的生物量的影響如圖2所示。試驗數據表明:在發酵進行的最初9 h，CTAB的存在對生物量的增長有一定的抑制作用，且隨著CTAB濃度的增加抑制作用增強。這與文獻[12］報道的高濃度的CTAB有一定的殺菌作用是一致的。發酵進行9 h后，CTAB對生物量增長的抑制作用減弱。這可能是由于生物量的增長使得單位胞外膜所結合的CTAB的分子數下降所致。另一方面，當菌外膜結合適當數量的CTAB時，細菌胞外膜通透性的提高有助于菌體與環境進行物質交換，很可能促進生物量的提高。發酵進行12 h后，添加0.009 5 g/L和0.027 0 g/L CTAB的試驗所得生物量達到并略超過空白試驗的生物量水平。此外，當發酵進行17 h后，4組試驗的微生物的增長都進入穩定期，表明CTAB對微生物的生長周期無明顯影響。在0～0.045 0 g/L的CTAB的條件下，發酵終端穩定的OD600值和pH值見圖3，圖3結果表明:該濃度下CTAB對產酸代謝和最終的生物量無明顯影響。

圖2 不同濃度的CTAB對發酵過程中的生物量的影響

圖3 培養基中不同濃度的CTAB對發酵終端的pH和OD600的影響

2.3 CTAB對發酵產氫過程的影響

厭氧發酵所產生的生物氣經氣相色譜分析未檢測到CH4和H2S，僅含有H2和CO2兩種氣體。這意味著混合菌中的產甲烷菌和硫酸鹽還原菌，在初始pH為6.0缺乏有機酸的培養基中幾乎沒有生長繁殖。生物氣經過堿洗裝置后所得氫氣的含量大于95%。

發酵過程中所產生的氫氣體積隨時間的變化曲線如圖4所示。由圖4可以看出:發酵的前8～10 h，CTAB對產氫過程有一定的抑制作用，且隨著CTAB濃度的增加抑制作用增強;發酵進行8～10 h后抑制作用減弱。且當CTAB濃度小于0.027 0 g/L時，產氫速率顯著提高。這與CTAB對混合菌生物量增長的影響規律一致(見圖2)。產氫發酵進行28 h后，不同CTAB濃度條件下的產氫過程全部終止，這暗示CTAB對產氫代謝持續的時間沒有影響。值得一提的是，當CTAB濃度在0～0.027 0 g/L的條件下，發酵所得累計產氫量隨著CTAB濃度的增加而增加。在0.027 0 g/L的CTAB環境下，獲得最大的累計產氫量為304 mL，此時產氫效率為13.6 mmol每克木糖，是對照試驗(未添加CTAB)的1.38倍。

圖4 不同濃度的CTAB條件下累計產氫體積隨發酵時間的變化

用優化的Logistic模型擬合產氫量隨時間的變化關系得到較高的相關性(R2≥0.99)。不同CTAB濃度條件下的擬合值，產氫潛力Pm、最大產氫速率Rm和停滯時間λ列于表1中。從表1中可以看出:當培養基中添加0～0.027 0 g/L CTAB時，累計產氫量、最大產氫速率以及產氫潛力隨著CTAB濃度的增加而增加。進一步提高CTAB的濃度，累計產氫量、最大產氫速率以及產氫潛力均下降。在添加0.027 0 g/L CTAB的條件下得到最大產氫潛力327 mL和最大產氫速率19.57 mL/h，分別較對照試驗提高了45%和44%。這說明通過改變胞外膜通透性能有效促進產氫代謝，這可能與胞內氫氣分壓的下降對產氫反應的促進作用和對吸氫反應的抑制作用有關。然而進一步提高培養基中CTAB的濃度，又表現出對產氫代謝的顯著抑制作用。0.045 0 g/L CTAB的條件下，所得累計產氫量和產氫速率分別為0.027 0 g/L CTAB的條件下的54%和60%，而在該濃度條件下CTAB對終端生物量和產酸代謝并無明顯抑制(見圖3)。文獻[13］報道產氣腸桿菌中產氫的關鍵性酶(氫酶)是膜結合酶。文獻[14］報道隨著CTAB濃度的增加，生物酶的活性下降。因此，過高濃度的CTAB對產氫過程的負面作用可能是由于氫酶的活性受到高濃度的CTAB的抑制引起的，這有待于進一步研究。

表1 不同濃度的CTAB 對發酵過程中的動力學參數的影響

另外，CTAB對產氫發酵的停滯時間也有顯著影響，且隨著CTAB濃度的增加停滯時間增加。在0.045 0 g/L的CTAB條件下，停滯時間由對照試驗的2.33 h增加至7.29 h。CTAB對產氫發酵的停滯時間的影響與CTAB對生物量增長的影響有關(見圖2)。

2.4 化學添加劑強化產氫發酵的文獻對比

本文研究得出CTAB是用于暗發酵產氫的一種有效的化學添加劑。文獻報道的化學添加劑對光發酵和暗發酵產氫的影響總結如表2所示。由表2可以看出:煙酸和MoO2-4對光發酵產氫過程的強化作用顯著，在適宜濃度的煙酸或者MoO2-4的環境下，產氫速率的強化倍數可達到3以上。各種添加劑對暗發酵過程中產氫速率和累計產氫量的強化倍數一般都小于2。本研究中CTAB與其他用于暗發酵的添加劑相比，累計產氫量和產氫速率的強化倍數相當，但CTAB的用量遠遠小于其他添加劑。

各種添加劑對產氫過程的作用機理不同。Ni2+，Fe2+和MoO2-4是氫酶或者鉬固氮酶的組成成分，所以添加Ni2+，Fe2+和MoO24促進了產氫的原因可能與氫酶或者鉬固氮酶活性的提高有關。添加乳酸對產氫過程的強化可能是由于甲酸和乙醇的代謝途徑向丁酸代謝途徑轉換所致[3］。有關L-胱氨酸的強化機理目前尚不清楚。本研究中CTAB對產氫發酵的強化作用可能是由于CTAB與胞外膜結合引起胞外膜溶解而使胞外膜的通透性提高。

表2 通過化學添加劑強化產氫發酵的文獻對比

3 結論

本研究通過在培養基中添加微量的CTAB，實現了強化發酵產氫的目的。CTAB對混合菌胞外膜通透性，對發酵過程中產氫速率、累計產氫量、生物量增長和產氫停滯時間都有一定程度的影響。

(1)濃度大于0.009 5 g/L的CTAB溶液可有效提高混合菌菌體胞外膜的通透性。

(2)在發酵過程中的前9 h內，CTAB對混合菌的生長繁殖有一定的抑制作用，但濃度小于0.045 0 g/L的CTAB對發酵終端的生物量沒有明顯影響;CTAB的存在使得產氫發酵過程中的停滯時間延長，且隨著CTAB濃度的增加而增加。

(3)0.095 0～0.027 0 g/L的CTAB可有效地強化混合菌的產氫發酵過程。并在CTAB濃度為0.027 0 g/L時得到最大產氫效率(13.6 mmol每克木糖)和最大的產氫速率(19.6 mL/h)，與對照試驗相比分別提高38%和44%。

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