旋毛蟲感染黑線倉鼠及其白化突變系后細胞因子變化比較分析

張小飛，劉 冉,2，崔曉霞，馬 帥，張西臣，白杰英

(1.軍事醫學科學院實驗動物中心，北京 100071；2.北京城市學院生物醫藥學部，北京 100081；3.吉林大學畜牧獸醫學院，長春 130062)

研究報告

旋毛蟲感染黑線倉鼠及其白化突變系后細胞因子變化比較分析

張小飛1，劉 冉1,2，崔曉霞1，馬 帥1，張西臣3，白杰英1

(1.軍事醫學科學院實驗動物中心，北京 100071；2.北京城市學院生物醫藥學部，北京 100081；3.吉林大學畜牧獸醫學院，長春 130062)

目的 比較旋毛蟲感染黑線倉鼠及其白化突變系后兩種動物免疫狀態的變化，建立適合感染寄生蟲的動物模型。方法 用旋毛蟲感染黑線倉鼠及其白化突變系后，通過檢測血細胞生理值、脾臟 IL-2蛋白濃度和脾臟 IL-6基因表達水平，分析兩種動物在感染旋毛蟲前后免疫應答水平及免疫調控狀態的變化。結果 黑線倉鼠在感染旋毛蟲后免疫細胞及細胞因子的水平高于白化突變系，反應程度更加劇烈。結論 黑線倉鼠是旋毛蟲感染的較為適宜的模型動物。

旋毛蟲；黑線倉鼠；白化突變系；細胞因子

旋毛蟲病是世界重要的食源性寄生蟲人畜共患病。人旋毛蟲病大多是由于吃了帶有旋毛蟲的生肉引起的，往往出現嚴重病癥，有的能引起死亡[1]。據王中全等[2]報道，目前我國人旋毛蟲病的暴發次數及發病人數與20世紀80～90年代相比有所下降，可能與旋毛蟲感染率的降低、肉檢工作的加強有關。人感染旋毛蟲后大部分臨床癥狀都是非特異性的，所以抗體檢測對旋毛蟲病的診斷具有重要意義。旋毛蟲的發育包括新生幼蟲、肌幼蟲和成蟲3個階段，產生的抗原具有非常顯著的期特異性[3]，旋毛蟲的宿主免疫系統對不同發育階段的旋毛蟲有著不同的免疫反應。細胞因子具有免疫調節作用，參與人體多種重要的生理功能。外來病原感染機體后，體內細胞因子存有量與部分功能將發生特異性變化。

黑線倉鼠(Cricetulusbarabensis)俗稱中國地鼠(Chinese hamster)，對許多致病細菌及病毒都具有高度的敏感性。如黑線倉鼠對白喉病比豚鼠更為易感，對結核菌的感染效果也遠遠超過小鼠，其癥狀和致病比豚鼠不僅早而且明顯。黑線倉鼠白化突變系是新培育的動物品種，與黑線倉鼠在生化指標上有差異[4]，本實驗用旋毛蟲感染黑線倉鼠及其白化突變系，分析比較兩者細胞因子變化，判斷機體免疫機能在感染前后的變化，建立最適旋毛蟲感染倉鼠模型。該模型將有助于深入了解感染宿主的免疫應答水平及免疫調控狀態，對旋毛蟲病的臨床診治和免疫預防具有一定的指導意義。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

黑線倉鼠和黑線倉鼠白化突變系(簡稱白化倉鼠)，體重(20～22)g，各18只(雌雄各半)，8周齡，購自軍事醫學科學院實驗動物中心[SCXK-(軍)2007-004]， 實驗動物使用合格證號：[SYXK-(軍)2007- 005]。

1.2 儀器和材料

胃蛋白酶和IL-2 ELISA kit(上海西唐)； RNA(Qiagen)；反轉錄試劑盒( PrimeScript RT reagent kit )、SYBR Premix Ex TaqTM II(TaKaRa)；DNAMarker2000(康為世紀)；Real Time PCR 擴增儀( Bio- Rar iQTM5)；血液分析儀。旋毛蟲獲贈于吉林大學農學部畜牧獸醫學院張西臣教授。

1.3 實驗方法

1.3.1 旋毛蟲制備及感染：取旋毛蟲感染的小鼠全身肌肉，剪碎后用蛋白酶消化液消化，37℃，18 h。細胞篩過濾，37℃中沉淀1 h，棄去上部約2/3的液體，加3倍以上經過預熱的生理鹽水稀釋。37℃中沉淀1 h，棄去上部約3/4的液體。重復洗3次，把最后剩下的液體用100目細胞篩過濾，用細胞計數板計數，獲得旋毛蟲脫囊幼蟲，加細胞培養液至濃度為100條/100 μL。

黑線倉鼠和白化倉鼠均分為8組，每組2只，1～8組灌胃300條旋毛蟲，9組灌胃生理鹽水，感染后第3、5、7天、第2、3、4、5、6周采集黑線倉鼠和白化倉鼠的抗凝血和脾臟保存備用。

1.3.2 血液生理值測定：本次實驗運用小鼠專用的血細胞分析儀測定，實驗材料取自實驗倉鼠的抗凝血。

1.3.3 脾臟IL-2 ELISA檢測：用來自上海西唐生物科技有限公司的白介素-2ELISA試劑盒，實驗采用雙抗夾心-ELISA法。用抗小鼠IL-2單抗包被與酶標板上，標準品和樣品中得IL-2與單抗相結合，加入生物素化的抗小鼠IL-2，形成免疫復合連接在板上，辣根過氧化物酶標記的streptavidin與生物素相結合，加入底物工作液后顯藍色，最后加終止液硫酸，在450 nm處測A值，繪制標準曲線計算標本中IL-2的濃度。

1.3.4 脾臟IL-6基因QRT-PCR檢測：使用QIAGEN RNA kit提取黑線倉鼠與白化突變系脾臟總RNA，電泳檢測其完整性，并使用ND2100 微量核酸蛋白測定儀測定核酸濃度和純度。

反轉錄體系：5× PrimeScriptTM buffer 4 μL，PimeScript RT Enzyme Mix 1. 0 μL，Oligo (dT) primer 1.0 μL， 隨機引物1.0 μL， Total RNA 2 μL，DEPC水加至20 μL。反應條件: 37℃ 30 min，85℃ 7 s，4℃ 保存。

根據Genbank上黑線倉鼠IL-6的DNA序列(序列號AF044667.1)設計引物，內參為β-actin。CIL-6上下游引物序列為5′-TTG GGA AAT TTG CCT ACT GAA-3′和5′-GTT TTG GTG GTG CTC TGA ATG AC-3′；β-actin上下游引物序列為 5′-AGT GTC CCA ACA TCC CAG C-3′和5′-GTG ACA CCG TCC CCA GAA T-3′，擴增產物長度149 bp。

標準曲線：以黑線倉鼠與白化突變系脾臟組織的 cDNA 為模板，按照3倍梯度稀釋5個濃度標準，進行QRT-PCR擴增(表1)。

表1 熒光定量PCR反應體系Tab.1 Reaction system of the real-time PCR

2 結果

2.1 血液生理值結果

實驗對血液生理值的4個指標進行統計分析，分別是白細胞計數(WBC)、淋巴細胞(LYM)、嗜酸性粒細胞(EOS)和嗜酸性粒細胞百分比(EOS%)。結果發現(圖1)，黑線倉鼠在感染后自第3天開始，WBC與LYM這兩數值均高于同時期的被感染的白化黑線倉鼠；EOS曲線，黑線倉鼠與白化黑線倉鼠在第5天、第2、第6周時數值基本相等；EOS%曲線中，二者百分比值在第5天、第3周處基本持平，黑線倉鼠的嗜酸性粒細胞含量在感染第3天時達到峰值。

同時比較黑線倉鼠和白化倉鼠感染前后白細胞計數和淋巴細胞的數值變化，白化黑線倉鼠與黑線倉鼠在感染后1周時，與感染前相比，白細胞含量有明顯增高，淋巴細胞在前3周明顯增加。

2.2 脾臟IL-2 ELISA結果

標準標準樣品繪制標準曲線圖，IL-2濃度計算方程為y=(A - D) / [1 + (x/C)^B] + D(A=3.83758；B=-1.93713；C=18.43249；D=0.07703；r2=0.99590)。血清IL-2含量的變化如圖2所示，在感染后第2周降低，從第二周后含量持續增長，黑線倉鼠和白化黑線倉鼠變化趨勢相同，但黑線倉鼠的IL-2整體水平均高于白化黑線倉鼠。

A：白細胞數量；B：淋巴細胞數量；C：嗜酸性粒細胞數量；D：嗜酸性粒細胞百分比圖1 黑線倉鼠及其白化突變系感染旋毛蟲后血液生理變化 A：WBC number；B：LYM number；C：EOS number；D：EOS%Fig.1 Changes of blood physiology of the Cricetulus barabensis and the albino mutant infected with Trichinella spiralis

左圖為標準曲線；右圖為IL-2濃度曲線圖2 黑線倉鼠及其白化突變系感染旋毛蟲后脾臟IL-2含量變化 Left: Standard curve; Right: IL-2 levelFig.2 Changes of IL-2 levels in the spleen of Cricetulus barabensis and the albino mutant infected with Trichinella spiralis

2.3 脾臟IL-6 QRT-PCR結果

提取的RNA用ND2000微量核酸蛋白測定儀測定RNA濃度A260/A280。各組樣品A260/A280的值在1.8～2.0之間，純度較好。如圖3和圖4所示，IL-6與cβ-actin的擴增曲線均較為平滑，沒有出現非正常的數值偏移，二者融解曲線中在85℃時均有一峰出現，且都為單一峰，判斷為目的峰，圖5中可以看出，二者的cβ-actin數值均較為平穩，黑線倉鼠的IL-6的含量自第3天開始至6周均為有規律的上下波動，白化黑線倉鼠的IL-6含量前3周有明顯降低，自第3周起開始回升，第6周IL-6含量明顯增加。

左圖為融解曲線；右圖為IL-6擴增曲線圖3 黑線倉鼠及其白化突變系感染旋毛蟲后脾臟IL-6 QRT-PCR反應 Left: Dissociation curves; Right: Amplification plots for IL-6Fig.3 IL-6 QRT-PCR reaction in the spleen of the Cricetulus barabensis and albino mutant infected with Trichinella spiralis

左圖為融解曲線；右圖為β-actin擴增曲線圖4 黑線倉鼠及其白化突變系感染旋毛蟲后脾臟β-actin QRT-PCR反應 Left: Dissociation curves; Right: Amplification plots for β-actinFig.4 β-actin QRT-PCR reaction in the spleen of Cricetulus barabensis and albino mutant infected with Trichinella spiralis

圖5 黑線倉鼠(B)及其白化突變系(W)感染旋毛蟲后脾臟IL-6變化曲線Fig.5 Changes of IL-6 in the spleen of Cricetulus barabensis (B) and the albino mutant (W) infected with Trichinella spiralis

3 討論

血液生理值檢測是判斷宿主動物是否感染寄生蟲的有效方法，同時可以反映機體全身免疫水平的變化。白細胞升高最常見原因是細菌感染，白細胞低說明免疫低下，極易感染各種病毒和細菌。劉向東研究發現旋毛蟲感染早期(第7天)蟲體周圍以嗜酸性粒細胞為主，感染3周出現以淋巴細胞和單核細胞為主的炎細胞浸潤[5]。外周血EOS含量增加是寄生蠕蟲感染，特別是組織內寄生蠕蟲感染時普遍存在的反應[6]。EOS必須在免疫血清存在的情況下才能發揮殺傷作用，免疫血清中的免疫分子補體和免疫球蛋白在其中發揮了重要作用[7]。楊樹國等[8]發現小鼠外周血中性粒細胞及淋巴細胞于第14 天后逐漸上升趨勢，21 d、28 d 達高峰，后逐漸下降。我們的研究發現，白細胞計數在倉鼠感染旋毛蟲1周后與感染前有明顯差異，白細胞總數升高，而淋巴細胞數值也在倉鼠感染旋毛蟲3周時與感染前差異最為明顯。通過圖1可以看出倉鼠在感染旋毛蟲后約在2周左右時生理值變化最為明顯，其中白細胞計數以及淋巴細胞數值變化最為快速。與小鼠研究相比，黑線倉鼠感染旋毛蟲后免疫細胞變化的峰值出現時間比小鼠更早，表明不同品系動物在免疫細胞的激活時間上有差異。

CD4+輔助細胞分為兩種不同的效應群[9]，Th1主要增強細胞介導作用，IL-2、IL-1β是Th1的重要細胞因子，Th2主要增強體液免疫作用，代表因子是IL-6。IL-1能激活胸腺細胞和T細胞，促進其增殖，表達IL-2受體，分泌細胞因子IL-2、IL-4、IL-6、INF-γ等，同時也是前炎性因子[10]。IL-2能夠直接影響的維持細胞免疫功能的重要細胞因子，在宿主感染旋毛蟲后的免疫反應中具有重要作用。在機體免疫應答中具有非常重要的作用，是一種免疫增強劑，具有抗病毒、抗腫瘤和提高機體免疫功能等作用[11]。

張光玉等[12]發現小鼠感染旋毛蟲后1～5周IL-2的含量較正常組明顯增加，且IL-2的含量呈下降趨勢，至感染第6周時已基本降至正常水平。但我們研究卻發現，黑線倉鼠及其白化突變系動物感染旋毛蟲后，IL-2的含量從第2周至第6周呈上升趨勢，表明黑線倉鼠的免疫反應性與小鼠有較大差異，不同動物對寄生蟲的敏感性不同，黑線倉鼠及其白化突變系動物在旋毛蟲移行至肌肉形成包囊的過程中，機體仍持續性分泌細胞因子，增強抵抗力。

IL-6又稱B細胞刺激因子，是一種具有多種生物學活性的多效性細胞因子，包括刺激B細胞、胸腺細胞和T細胞分化，激活巨噬細胞和NK細胞，刺激肝細胞產生急性期蛋白(APP)而改變一系列在急性炎癥反應中起關鍵作用的肝源性血清蛋白的濃度，幾乎能影響免疫系統的所有細胞，主要誘導活化后期的B細胞，此IL-6在免疫反應及炎癥反應中扮演重要角色。本試驗應用SYBR green實時熒光定量技術以黑線倉鼠基因序列為靶基因設計了IL-6的引物，成功建立了黑線倉鼠和白化黑線倉鼠細胞因子快速定量檢測方法。

對旋毛蟲感染白化黑線倉鼠機體免疫水平的研究表明，該動物對寄生蟲敏感，可作為旋毛蟲病的感染動物模型應用，而且黑線倉鼠的免疫反應性比其白化突變系動物更高。該模型的成功建立，不僅對旋毛蟲這類寄生蟲病的預防、提早發現和診斷提供參考，而且還可以為后續的寄生蟲病方面的深入研制以及相關藥物研發提供幫助，未來具有較為廣闊的發展空間。

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Changes of cytokines in theCricetulusbarabensisand their albino mutant infected withtrichinellaspiralis

ZHANG Xiao-fei1, LIU Ran1,2, CUI Xiao-xia1, MA Shuai1, ZHANG Xi-chen3, BAI Jie-ying1

(1. Laboratory Animal Center, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071, China;2. College of Biotechnology, Beijing City University, Beijing100081, China;3. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Jilin University, Changchun 130062)

Objective To explore the differences in immune responses betweenCricetulusbarabensisand their albino mutant infected withTrichinellaspiralis. Methods The physiological parameters of blood, expression levels of IL-2 protein and IL-6 gene in the spleen were analyzed. Results The level of immune cells and cytokines ofCricetulusbarabensiswas higher than that in the albino mutant. ConclusionsCricetulusbarabensisis a suitable model animal for research on long-term latent infection such as infection withTrichinellaspiralis.

Trichinellaspiralis；Cricetulusbarabensis；Albino mutant；Cytokines

軍事醫學科學院創新基金(2012CXJJ022)，動物中心青年基金(QN2011005)，“十二五”重大項目(2011zxj09201-031)。

張小飛(1979-)，女，實驗師。E-mail: 15810074189@163.com。

白杰英(1977-)，男，副研究員，主要從事實驗動物免疫與生物化學研究。E-mail: baijieying@126. com。

R33

A

1671-7856(2014) 08-0011-05

10.3969.j.issn.1671.7856. 2014.008.003

2014-05-22