2,4-滴丁酯對雄性小鼠的生殖毒性作用

劉艷冬， 宋飛玉，馬曉明， 王 琳，毛 磊， 洪 迪， 宋祥福

(1．吉林大學公共衛生學院，長春 130021；2.吉林康乃爾藥業有限公司，吉林 132013)

研究報告

2,4-滴丁酯對雄性小鼠的生殖毒性作用

劉艷冬1， 宋飛玉2，馬曉明1， 王 琳1，毛 磊1， 洪 迪1， 宋祥福1

(1．吉林大學公共衛生學院，長春 130021；2.吉林康乃爾藥業有限公司，吉林 132013)

目的 研究2,4-滴丁酯對雄性小鼠的生殖毒性作用。 方法 將48只雄性ICR小鼠隨機分為4組，即對照組(玉米油)和低(10 mg/kg)、中(20 mg/kg)和高劑量(40 mg/kg)2,4-滴丁酯染毒組，每組12只。采用灌胃方式進行染毒，每天1次，每周連續染毒6 d，實驗周期為5周。染毒結束后采用分光光度法對睪丸組織中總抗氧化能力(T-AOC)、乳酸脫氫酶(LDH)、琥珀酸脫氫酶(SDH)、Na+K+-ATPase及Ca++Mg++-ATPase的活性進行測定。結果 T-AOC活力隨著2,4-滴丁酯染毒劑量的升高逐漸下降，高劑量組與其他組比較差異顯著；與對照組和低劑量2,4-滴丁酯染毒組相比較，高、中劑量組睪丸組織中LDH活力值較低，差異顯著，且高劑量組與中劑量組比較差異顯著；SDH活力隨著2,4-滴丁酯染毒濃度的升高逐漸降低，高、中劑量組與對照組相比較差異顯著，且高劑量組與中、低劑量組比較差異顯著；與對照組和低劑量2,4-滴丁酯染毒組相比較，高、中劑量組睪丸組織中Na+K+-ATPase活力值較低，且差異顯著；實驗組Ca++Mg++-ATPase活力與對照組比較差異顯著。結論 2,4-滴丁酯染毒對雄性小鼠睪丸組織具有一定的毒性作用。

2,4-滴丁酯；睪丸；SDH；LDH；ATPase；T-AOC；生殖毒性

2.4-D丁酯為苯氧乙酸類激素型選擇性除草劑，其性質為無色油狀液體，難溶于水，易溶于多種有機溶劑，是世界上使用最廣泛的除草劑之一。2,4-滴丁酯屬于低毒性除草劑，急性中毒少見[1]。但是2,4-滴丁酯揮發性強、分布范圍廣，常因使用不恰當而對環境造成污染，并可通過食物鏈進入人體，對生態環境和人類健康造成嚴重的危害[2,3]，因而其毒性和殘留問題日益受到人們的重視。國內外曾報道過2,4-滴丁酯中毒的病例，臨床癥狀早期主要表現為：頭暈、無力、惡心、嘔吐、煩躁等，隨著病情的發展可出現多臟器的損害[4]。目前關于2，4-滴丁酯的生殖毒性及其作用機制研究較少。本研究旨在從能量代謝及抗氧化能力的角度出發，探討2,4-滴丁酯對雄性小鼠的生殖毒性作用及機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

雄性清潔級ICR小鼠48只，體質量(25±2)g，由吉林大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證編號為【SCXK(吉)2007-0003】。

1.2 主要試劑與儀器

2,4-滴丁酯(上海至鑫化工有限公司)；總抗氧化能力(T-AOC)測試盒、乳酸脫氫酶(LDH)測試盒、琥珀酸脫氫酶(SDH)測試盒、三磷酸腺苷(ATP)酶測試盒、總蛋白定量測試盒(南京建成生物工程研究所)。

恒溫水浴箱(北京西城區醫療器械廠)；低速自動平衡離心機(北京醫用離心機廠)；722型分光光度計(北京醫療設備二廠)。

1.3 動物分組及染毒方法

將48只雄性清潔級ICR小鼠適應性喂養1周后，隨機分為4組，即對照組(玉米油)和低(10 mg/kg)、中(20 mg/kg)和高劑量(40 mg/kg)2,4-滴丁酯染毒組。采用灌胃方式進行染毒，實驗組均給予0.27 mL 2,4-滴丁酯染毒溶液，對照組給予等量的玉米油，每天1次，每周連續染毒6 d，共5周。每周末稱量并記錄小鼠體重，根據體重確定下周的染毒劑量。

1.4 樣本的采集與制備

于末次染毒結束后24 h，處死小鼠，取出雙側睪丸，再稱取適量睪丸組織，在冰水浴條件下，加生理鹽水研磨后，制備成10%的組織勻漿，2 500 r/min離心15 min，取上清液待測。

1.5 樣本的測定

將制備好的待測上清液嚴格按照T-AOC、LDH、SDH、Na+K+-ATPase、Ca++Mg++-ATPase測試盒說明書檢測樣品的吸光度，根據相應的公式計算出相應酶的活力。組織中的蛋白含量采用考馬斯亮藍法測定。

1.6 統計學方法

全部測定數據采用統計軟件SPSS 13.0進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 睪丸組織中T-AOC活力的測定結果

T-AOC活力隨著2,4-滴丁酯染毒劑量的升高逐漸下降，高劑量組與其他組比較差異顯著，見表1。

表1 2,4-滴丁酯染毒對小鼠睪丸組織T-AOC活力的影響Tab.1 Effects of 2,4-D butylate on the T-AOC activity in the testis tissue of mice

注:a與對照組進行比較P﹤0.05；b與低劑量組進行比較P﹤0.05；c與中劑量組進行比較P﹤0.05。

Note.aCompared with the control group,P<0.05;bCompared with the low dose group,P<0.05;cCompared with the moderate dose group,P<0.05.

2.2 睪丸組織中LDH和SDH的活力

LDH和SDH活力均隨著2,4-滴丁酯染毒濃度的升高逐漸降低，與對照組和低劑量組相比較，高、中劑量組睪丸組織中LDH活力值較低，差異顯著，且高劑量組與中劑量組比較差異顯著；高、中劑量組睪丸組織中SDH活力與對照組相比較差異顯著，且高劑量組與中、低劑量組比較差異顯著，見表2。

2.3 睪丸組織中Na+K+-ATPase 及Ca++Mg++-ATPase 的活力

與對照組和低劑量組相比較，高、中劑量組睪丸組織中Na+K+-ATPase活力值較低，且差異顯著；實驗組Ca++Mg++-ATPase活力與對照組比較差異顯著，見表3。

表2 2,4-滴丁酯對小鼠睪丸組織中LDH和 SDH活力的影響Tab.2 Effects of 2,4-D butylate on the activities of LDH and SDH in the testis tissue of mice

注:a與對照組進行比較P<0.05；b與低劑量組進行比較P<0.05；c與中劑量組進行比較P<0.05。

Note.aCompared with the control group,P<0.05;bCompared with the low dose group,P<0.05;cCompared with the moderate dose group,P<0.05.

表3 2,4-滴丁酯對小鼠睪丸組織中ATPase 活力的影響Tab.3 Effects of 2,4-D butylate on the activity of ATPase in the testis tissue of mice

注:a與對照組進行比較P<0.05；b與低劑量組進行比較P<0.05。

Note.aCompared with the control group,P<0.05;bCompared with the low dose group,P<0.05.

3 討論

總抗氧化能力(T-AOC)代表體內酶類和非酶類抗氧化物質的總體水平，是反映機體抗氧化能力的綜合指標，主要通過清除自由基及分解過氧化物等，維持體內助氧化與抗氧化系統的動態平衡，使機體處于氧化還原相對穩定的狀態，且可以克服某種特定抗氧化指標難以全面反映組織抗氧化能力的局限性，更能準確、全面地反映機體的抗氧化能力[5]。有研究表明2,4-二氯苯氧乙酸類物質能夠通過誘導機體產生過多的自由基，破壞細胞膜的完整性，損傷細胞內的抗氧化防御體系，減少抗氧化酶的含量[6,7]。本次實驗小鼠睪丸組織中T-AOC活力有隨著2,4-滴丁酯染毒濃度的升高逐漸下降的趨勢，與高劑量2,4-滴丁酯染毒組相比較，中、低劑量組和對照組睪丸組織中T-AOC活力值較高，且差異顯著。結果表明中、低劑量的2,4-滴丁酯染毒對小鼠睪丸組織的抗氧化能力影響不大；高劑量2,4-滴丁酯染毒可使T-AOC活力明顯降低說明小鼠體內抗氧化防御系統的動態平衡被打破，體內過多的自由基不能有效的被清除，而對睪丸組織產生了氧化損傷作用。

LDH屬于糖酵解酶系，由生精細胞產生，存在于曲細精管胞漿中，其作用是在糖酵解過程中催化丙酮酸轉化為乳酸， 其活性與生精過程中的能量代謝及生精上皮的成熟密切相關，是生精細胞成熟的標志酶之一[8]。SDH屬于線粒體的標志酶，存在于生精小管的支持細胞和生精細胞的線粒體內，其作用是最終將果糖轉化為葡萄糖而進行能量代謝，在精子的能量代謝過程中起到重要作用，可作為睪丸成熟、精子功能成熟和形態完善的標志酶[9]。因此，LDH和SDH活性變化是反映生殖毒性作用的敏感指標之一。本次實驗小鼠睪丸組織中LDH和SDH活力均隨著2,4-滴丁酯染毒濃度的升高逐漸降低，且與對照組相比，高、中劑量組LDH和SDH活性顯著性降低，結果表明高、中劑量的2,4-滴丁酯染毒可通過干擾生殖細胞的糖酵解和有氧呼吸過程，導致能量的供應不足，影響精子的生成與成熟。

ATPase 是廣泛分布在體內的生物膜酶系統，是細胞進行能量轉換的重要系統，而Na+K+-ATPase和Ca++Mg++-ATPase是其主要成員。ATPase 是睪丸內能量代謝的關鍵酶, 也是質膜上重要的離子泵，不僅可以影響能量的產生、轉移和利用，還可以維持細胞膜正常的膜電位變化和內環境的穩定，因此其活性高低是反映機體能量代謝水平和細胞膜損傷的重要指標[10]。本次實驗結果表明Na+K+-ATPase和Ca++Mg++-ATPase活力均隨著2,4-滴丁酯染毒劑量的升高呈下降的趨勢，提示：2,4-滴丁酯染毒可通過抑制睪丸生殖細胞的能量轉換，影響細胞膜結構的完整性和內環境的穩定，對生殖細胞造成損傷。

綜上所述，2.4-滴丁酯染毒可引起小鼠睪丸組織內T-AOC、LDH、SDH、Na+K+-ATPase和Ca++Mg++-ATPase活性降低，說明2,4-滴丁酯可能通過影響生殖細胞的抗氧化能力、干擾生殖細胞糖酵解和有氧呼吸過程影響產能及抑制生殖細胞對能量的利用，對雄性小鼠睪丸組織發揮毒性作用。

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Reproductive toxicity of 2,4-D butylate to male mice

LIU Yan-dong1, SONG Fei-yu2, MA Xiao-ming1, WANG Lin1, MAO Lei1, HONG Di1, SONG Xiang-fu1

(1. School of Public Health of Jilin University, Changchun 130021, China;2. Jilin Connell Pharmaceutical. Co., Ltd, Jilin 132013, China)

Objective To explore the reproductive toxicity of 2,4-D butylate to the testis in male mice．Methods Forty-eight ICR male mice were randomly divided into four groups: the control group, and three 2,4-D butylate experimental groups (10, 20, 40 mg/kg), 12 mice in each group. 2,4-D butylate was intragastrically administered once a day and six days per week for five weeks. At the end of the exposure, the activities of total antioxidant capacity (T-AOC), Na+K+-ATPase, Ca+ +Mg+ +-ATPase, lactate dehydrogenase (LDH) and succinate dehydrogenase (SDH) in testis homogenate were measured by spectrophotometry. Results The activity of T-AOC was gradually decreased with the increase of doses, with a significant difference between the high dose group and other groups. The activities of LDH in the moderate and high dose groups were significantly lower than those of the low dose group and control group, and there was a significant difference between the high dose group and moderate dose group. The activities of SDH in the testis was gradually decreased with the increase of the 2,4-D butylate dose, showing significant differences between the high dose group and the moderate dose and control groups, and between the high and moderate dose groups and the low dose group. The activities of Na+K+-ATPase in the moderate and high dose groups were significantly lower than that of the control and low dose group. The activities of Ca++Mg++-ATPase was significantly lower in the experimental groups than that in the control group. Conclusion Exposure to 2,4-D butylate has certain toxic effect on the testicular tissue in male mice.

2,4-D butylate；Testis；SDH；LDH；ATPase；T-AOC；Reproductive toxicity; Male mice

劉艷冬(1986-)，男， 在讀碩士；研究方向：農藥對機體的影響。E-mail： liu502yandongzly@126.com。

宋飛玉(1975-)，女，研究方向：藥物毒理。E-mail： songfeiyu2008@163.com。

R33

A

1671-7856(2014) 08-0016-03

10.3969.j.issn.1671.7856. 2014.008.004

2014-05-21