靶向ER-α36的vshRNA真核表達慢病毒載體的構建、鑒定及其對胃癌細胞增殖的影響*

王緒明， 黃 萱， 付政祺， 鄒 豐， 張尚昆， 王兆一， 劉麗江△

(江漢大學 1醫學院病理學與病理生理學教研室， 2江大病理診斷所組織病理診斷部，湖北 武漢 430056)

·論 著·

靶向ER-α36的vshRNA真核表達慢病毒載體的構建、鑒定及其對胃癌細胞增殖的影響*

王緒明1, 2， 黃 萱1, 2， 付政祺1, 2， 鄒 豐1， 張尚昆1， 王兆一1， 劉麗江1, 2△

(江漢大學1醫學院病理學與病理生理學教研室，2江大病理診斷所組織病理診斷部，湖北 武漢 430056)

目的： 針對雌激素受體(ER)-α36基因的特異性靶序列, 構建并鑒定靶向ER-α36基因RNAi慢病毒載體，研究ER-α36沉默后對胃癌細胞增殖的影響。方法: 篩選確定的ER-α36 基因RNAi有效靶序列，合成靶序列的Oligo DNA，與慢病毒載體(GV307)連接，測序鑒定。轉染293T細胞，包裝產生慢病毒，感染胃癌SGC7901細胞株。熒光顯微鏡下觀察SGC7901感染后熒光表達情況，real-time PCR和Western blotting方法檢測ER-α36的表達變化。用1×10-10mol/L 的17β-雌二醇處理沉默ER-α36的SGC7901細胞，用細胞計數法觀察細胞增殖能力的變化及檢測相關下游信號通路分子Src、ERK1/2、cyclin D1表達的變化。結果: 陽性克隆PCR及測序證明成功構建慢病毒載體LV-ER-α36-RNAi，倒置顯微鏡下觀察LV-ER-α36-RNAi慢病毒載體感染率達80%以上。 Real-time PCR和Western blotting方法證實四環素(TeT)誘導下LV-ER-α36-RNAi明顯抑制SGC7901細胞內ER-α36 mRNA和蛋白質的表達。與對照組相比，沉默ER-α36的SGC7901細胞增殖能力減弱，Src、ERK1/2、cyclin D1蛋白表達明顯降低，Src蛋白活化能力減弱(P<0.05)。結論: 我們構建的TeT誘導靶向ER-α36的vshRNA慢病毒載體LV-ER-α36-RNAi，可明顯沉默ER-α36的表達，為研究ER-α36蛋白的作用機理提供實驗依據，ER-α36與胃癌細胞等腫瘤細胞的增殖有關。

SGC7901細胞； 雌激素受體α36； 慢病毒載體

雌激素受體α36(estrogen receptor α36，ER-α36)是新近發現的ER-α (又稱ER-α66)的亞型，由310個氨基酸組成，分子量35.7 kD，其基因編碼序列位于人類染色體6q 24.2～25.3(GenBank ID: BX640939.1)，目前的研究發現其蛋白質主要定位于細胞膜。ER-α36與ER-α66不同的是擁有一段特有的氨基酸序列，即在末端有27個氨基酸與ER-α66不同。由此針對這個區段的氨基酸可獲得特異性的ER-α36抗體，使得對ER-α36蛋白的研究變得更為容易[1]。

近10年的研究有越來越多的證據顯示，雌激素在雌激素依賴性腫瘤(如乳腺癌等)以及雌激素非依賴性腫瘤(呼吸道及消化道腫瘤等)中均發揮著非常重要的作用[2-7]，其中ER-α36在乳腺癌的耐藥方面和雌激素非依賴性腫瘤的發生與發展方面可能比ER-α66發揮更為重要的介導雌激素信號的作用[2, 8-10]。為了進一步闡明ER-α36蛋白的作用原理以及在腫瘤細胞信號傳遞中的效應機制，敲減其表達是重要的體外研究手段之一。因此，我們探索構建靶向ER-α36的慢病毒短發夾狀RNA (vshRNA)真核表達載體的技術問題，以解決敲減腫瘤細胞內ER-α36的表達，研究其介導雌激素信號的作用機制。

材 料 和 方 法

1 材料和試劑

293T細胞購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫；人胃癌細胞株SGC7901由華中科技大學同濟醫學院免疫學教研室饋贈；大腸桿菌菌株DH5α購自天根生化科技(北京)有限公司；XhoI、EcoR I及T4 DNA連接酶購自New England Biolabs；RNA干擾慢病毒載體TetIIP-Turbo-RFP-MCS(MIR30)-Ubi-TetR-IRES-Puromycin(GV307)和病毒包裝質粒、GV307重組載體、pHelper 1.0和pHelper 2.0均購自上海吉凱基因化學技術有限公司；感染試劑Lipofectamine 2000(11668019)購自Invitrogen；DMEM液體培養基和胎牛血清購自Hyclone；兔多克隆抗人ER-α36抗體由王兆一教授(美國，Creighton大學醫學院)饋贈；兔抗人Src 抗體、p416-Src 抗體、 p527-Src 抗體、兔抗人cyclin D1 抗體、兔抗人ERK1/2 抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG及辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG購自Santa Cruz；鼠單克隆抗體β-actin購自武漢博士德生物工程有限公司；用于Western blotting檢測的增強化學發光試劑ECL和BCA蛋白定量試劑盒為上海碧云天生物技術有限公司產品；PVDF轉印膜購自Millipore；One Step Reverse Transcript-PCR試劑盒為Qiagen產品；SYBR Master Mixture 購自TaKaRa；四環素(tetracycline，TeT)粉劑購自中國生物制品研究所；其他生化試劑均為進口分裝或國產分析純；1，5-二甲基-1，5、二氮十一亞甲基聚甲溴化物(polybrene；感染添加劑)由上海吉凱基因化學技術有限公司提供；引物的合成及DNA序列測定均委托上海吉凱基因化學技術有限公司完成。

2 主要方法

2.1 靶向ER-α36的vshRNA設計和構建 根據GenBank數據庫獲得ER-α36 (BX640939.1)的序列，設計合成多對針對ER-α36基因shRNA的寡核苷酸序列，選擇最佳的動力學參數靶點(AGC AGA GTG GTA CGG TTA A)進入后續實驗流程。確定針對目的基因shRNA的有效靶點后，合成雙鏈DNA，與GV307載體連接，轉化感受態大腸桿菌DH5α，挑取重組陽性克隆行PCR及測序鑒定(ABI公司3730型DNA測序儀進行測序分析)。挑選轉化子重懸于10 μL Luria-Bertani(LB)培養基，混勻取1 μL作為模板；使用GV307載體通用引物，進行菌落PCR鑒定實驗。PCR鑒定陽性克隆的上游引物為5’-AGA CCT ACG TCG AGC AGC AC-3’， 下游引物為 5’- TCC GTC TCG TGT CTT GTT GC-3’。

2.2 慢病毒包裝 胰蛋白酶消化處于對數生長期的293T細胞用于轉染，制備慢病毒包裝系統中3種質粒的混合溶液[LV-ER-α36-RNAi載體或GV307-NC(GV307-negative control)20 μg，pHelper 1.0(gag/pol元件)載體15 μg，pHelper 2.0(VSVG元件)載體10 μg]，與相應體積的Opti-MEM混合均勻。將稀釋后的質粒與稀釋后的Lipofectamine 2000進行混合，將混合液轉移至293T細胞的培養液中，放入37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養。8 h后， PBS洗滌。加入含10%胎牛血清(FBS)的細胞培養基，繼續培養48 h。收集轉染后48 h的293T細胞上清液。經離心過濾，即可獲得病毒濃縮液。將病毒濃縮液移出，測定滴度后，分裝-150 ℃保存備用。

2.3 慢病毒感染 選取人胃癌SGC7901細胞，以1×105個數量的細胞接種于6孔板中，含10% FBS的DMEM培養基體積為2 mL，待細胞長至70%。將凍存的LV-ER-α36-RNAi病毒顆粒和GV307-NC病毒顆粒取出冰浴融化，用無血清DMEM培養基稀釋病毒滴度至1×1011TU/L，按20 μL/well的用量，將含有LV-ER-α36-RNAi載體的慢病毒感染胃癌SGC7901細胞, 同時以GV307-NC病毒顆粒為對照(vector-control)，均加入終濃度為10 mg/L的polybrene以提高病毒感染效率。

2.4 熒光顯微鏡檢查感染效率及實驗分組 取LV-ER-α36-RNAi以最適感染復數(multiplicity of infection, MOI)值感染SGC7901胃癌細胞株，置于37 °C、5% CO2培養箱內孵育48 h。根據感染情況將相同時點的SGC7901細胞分為2組感染組：感染LV-ER-α36-RNAi；感染加TeT處理組感染LV-ER-α36-RNAi同時加上2 mg/L TeT處理。在倒置熒光顯微鏡下觀察感染后48 h時熒光表達情況，評價細胞感染效率。

2.5 Real-time PCR方法檢測重組質粒對ER-α36 mRNA表達的影響 實驗分為未感染組、陰性對照組(vector-control)和感染組(LV-ER-α36-RNAi組)、感染+不同濃度TeT處理組(感染LV-ER-α36-RNAi后采用0.5 mg/L、1 mg/L、2 mg/L和4 mg/L TeT 處理)。SGC7901細胞分別感染LV-ER-α36-RNAi或GV307-NC 48 h后，收集mRNA，逆轉錄成cDNA后，用特異性引物進行real-time PCR檢測。ER-α36的上游引物為5’-ACA AGT GGT TTC CTC GTG TCT AA-3’，下游引物為5’-GGG TGT TGA GTG TTG GTT GC-3’；GAPDH的上游引物為5’-TGA CTT CAA CAG CGA CAC CCA-3’，下游引物為5’-CAC CCT GTT GCT GTA GCC AAA-3’。Real-time PCR的擴增條件為95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃ 30 s，35個循環。

2.6 Western blotting法檢測重組質粒對ER-α36、Src、ERK、cyclin D1、p416-Src及p527-Src蛋白表達的影響 檢測ER-α36、Src、ERK、cyclin D1蛋白的表達，實驗分為未感染組、陰性對照組(vector-control)、感染組(LV-ER-α36-RNAi組)和感染+TeT處理組(LV-ER-α36-RNAi+2 mg/L TeT)。將上述分組細胞分別在48 h和72 h后提取總蛋白，進行SDS-PAGE。檢測p416-Src及p527-Src蛋白表達，實驗分為未感染組和感染+TeT處理組(LV-ER-α36-RNAi+2 mg/L TeT)。細胞經含2%活性炭吸附的FBS(cFBS)的無酚紅1640處理2 d，再經無血清無酚紅1640處理6 h，目的是去除雌激素的影響，再加入終濃度為0 mol/L和1×10-10mol/L 17β雌二醇(17β-estrodial), 5% CO2、37 ℃孵育10 min和20 min，然后分別將上述分組細胞提取總蛋白。將蛋白定量后進行SDS-PAGE，電泳后濕轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉37 ℃封閉60 min，抗ER-α36、Src、ERK1/2、cyclin D1、p416-Src及p527-Src蛋白的抗體4 ℃孵育過夜。TBST漂洗5 min×3次， 加入相應的辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠或羊抗兔IgG，37 ℃孵育60 min。TBST漂洗5 min×3次，ECL化學發光試劑檢測。

2.7 細胞計數法檢測雌激素處理下，ER-α36對胃癌細胞增殖能力的影響 實驗分為未感染組及感染+TeT處理組(LV-ER-α36-RNAi+2 mg/L TeT)。分別將上述分組細胞經除去雌激素影響處理后，收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，10 cm玻璃平底板每板加入10 000個細胞。分別加入0 mol/L和1×10-10mol/L 17β-estrodial, 5% CO2、37 ℃孵育5 d和7 d。然后收集細胞用手持ScepterTM2.0細胞計數儀計數，實驗重復3次。

3 統計學處理

實驗數據以均數±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 13.0統計軟件進行方差分析或t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

3.讓傳播對象感到我們是“命運共同體”。說一些共同關注的話題，多一點對重大事件和熱點事件的參與，構建出彼此尊重、合作雙贏、共同發展的“命運共同體”，使傳播內容更具針對性、親和力和公信力。

結 果

1 重組質粒的鑒定

將陽性克隆進行PCR實驗并送測序， 測序結果證實設計序列正確插入載體且無突變，見圖1。

Figure 1.The sequencing result of LV-ER-α36-RNAi was in accordance with the design planning.

圖1 慢病毒載體LV-ER-α36-RNAi測序結果

2 LV-ER-α36-RNAi慢病毒感染

未加TeT處理的感染組的SGC7901細胞48 h后未出現紅色熒光標記，感染加TeT處理組的SGC7901細胞48 h后, 熒光顯微鏡觀察顯示細胞中均表達紅色熒光蛋白，提示TeT成功誘導紅色熒光蛋白的表達，重組質粒48 h轉染效率為80%以上，提示病毒的滴度及轉染的效率均比較好，見圖2。

Figure 2.The cell infection rate (48 h after transfection, ×200). A，B: transfected group ；C，D: transfected group with TeT stimulation.

圖2 病毒顆粒感染SGC7901細胞48 h后紅色熒光蛋白的表達

3 Real-time PCR方法檢測結果

相對于未感染組SGC7901細胞(SGC7901)而言，陰性對照組SGC7901細胞(vector-control)，ER-α36基因無敲減(P>0.05)；感染組SGC7901細胞(Low36)，ER-α36基因無敲減(P>0.05)；感染加TeT處理組(Low36+TeT)，0.5、1、2和4 mg/L TeT分別處理48 h，ER-α36基因敲減效率達到約14.3%、31.3%、65.1%和65.9%; 0.5、1、2和4 mg/L TeT分別處理72 h，ER-α36基因敲減效率達到約24.6%、34.3%、72.9%和73.1%，見圖3。上述結果提示，TeT成功誘導Low36細胞沉默ER-α36 mRNA表達，具有時間和劑量依賴性，從量效比來看，2 mg/L TeT是最佳誘導濃度。

Figure 3.The mRNA expression of ER-α36 detected by real-time PCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsSGC7901.

圖3 Real-time PCR檢測ER-α36 mRNA表達

4 Western blotting方法檢測結果

5 細胞計數法及Western blotting方法檢測結果

細胞計數法檢測結果顯示，在濃度為1×10-10mol/L 的17β-estrodial誘導下，沉默ER-α36的SGC7901細胞(Low36)，cyclin D1表達降低，增殖能力弱于SGC7901細胞(P<0.05)。在TeT處理下分別沉默ER-α36 48 h和72 h后，與未沉默組相比，Src、ERK1/2及cyclin D1蛋白表達降低(P<0.05)，見圖5。相對于SGC7901細胞而言,低濃度雌激素在10 min未能誘導Low36細胞Src蛋白416位點磷酸化，在20 min時有微弱的磷酸化，而Src蛋白527位點磷酸化未能明顯降低，說明沉默ER-α36以后，雌激素誘導Src的416位點活化能力降低，見圖6。上述結果提示，ER-α36與胃癌細胞增殖能力有關，Src、ERK1/2及cyclin D1等可能參與ER-α36介導的胃癌細胞增殖的信號通路轉導途徑。

Figure 4.Inhibitory effects of LV-ER-α36-RNAi on the protein expression of ER-α36. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsSGC7901.

圖4 LV-ER-α36-RNAi對ER-α36蛋白表達的抑制效應

Figure 5.The results of cell counting and Western blotting analysis. A: the results of cell counting； B，C: the results of Western blotting analysis. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsSGC7901 at 7 d;△P<0.05vsvector-control at 48 h;#P<0.05vsvector-control at 72 h.

圖5 細胞計數法及Western blotting法檢測結果

討 論

逆轉錄病毒是一種單股正鏈RNA病毒，核心區域含有編碼核心蛋白(gag)、編碼逆轉錄酶(pol)和編碼包膜蛋白(env)3種重要基因結構，是一種高效感染病毒，可以感染幾乎所有的活細胞[11]。慢病毒(lentivirus)是逆轉錄病毒的一種，利用慢病毒載體構建的沉默基因表達載體，其效率遠遠高于物理或化學方法的轉染[12]。TeT調控基因表達系統是基于大腸桿菌四環素操縱子基礎上建立的可人工調節基因表達的操控系統[13]。TeT調控系統包括TeT-on(激活表達)和TeT-off(關閉表達)2種模式，可以安全有效地調控外源基因在真核細胞的表達水平[14]。

本實驗中構建的沉默ER-α36的慢病毒載體選用GV307病毒載體，其載體序列為TetIIP-Turbo-RFP-MCS(MIR30)-Ubi-TetR-IRES-Puromycin。慢病毒的基因組所含的CpG島更少，降低宿主的免疫反應性，可以更優地發揮其基因沉默的作用，同時又幾乎不引起宿主的免疫反應[15,16]。我們的實驗結果證實，轉染了沉默ER-α36的慢病毒載體后，若不給予TeT處理，ER-α36并沒有被敲減，而給予了TeT處理后，ER-α36就被明顯敲減了。因此，含有四環素調控位點的GV307病毒載體，不僅攜帶有沉默ER-α36的片段，還帶有控制其表達的開關，這是保證實驗研究非常重要的技術手段。

我們構建的沉默ER-α36的慢病毒載體，是深入研究雌激素- ER-α36在胃癌中作用及機制的前提之一。本項研究的結果顯示，胃癌SGC7901細胞被感染的第48 h，轉染效率在80%以上，測序結果顯示，基因設計序列正確插入載體且無突變。Real-time PCR結果顯示，ER-α36基因敲減效率達到約73%。Western blotting結果顯示，在感染的第48 h和72 h，ER-α36蛋白表達降低且有統計學差異。

胃癌是中國常見高發惡性腫瘤之一，流行病學研究發現，胃癌的發生具有男性明顯多于女性的特點，而這種性別的差異在女性絕經后消失[17]。因此，胃癌的發生顯然與雌激素有某種關聯，但是雌激素信號的轉導又與ER-α66的關系不緊密[18]。我們的前期研究發現，胃癌細胞和人體胃癌組織樣本中均有ER-α36的表達，并在胃癌組織、癌旁組織及遠離胃癌的組織中呈遞減的趨勢，且與患者的年齡、腫瘤的大小、組織學分級以及淋巴結轉移相關[8-9]。

Figure 6.Expression of p416-Src and p527-Src in SGC7901 cells (A) and Low36 cells (B) treated with 1×10-10mol/L 17β-estrodial at different time points. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsp416-Src/Src at 0 min;#P<0.05vsp527-Src/Src at 0 min.

圖6 Western blotting法檢測結果

雌激素通過ER-α36經c-Src信號通路調控胃癌細胞的生長，在正常情況下, Src-SH2結構域與 C 端 Tyr527 結合, 后者被蛋白酸氨酸激酶(protein tyrosine kinase，PTK)磷酸化, 使整個分子呈頭尾卷曲狀態, 將 Src 激酶活性中心遮蓋, 因而 Src 激酶活性處于抑制狀態。Tyr527 的去磷酸化就可使 Src 活化, Src 激酶一旦解除了抑制狀態, PTK 功能域內一個關鍵酪氨酸殘基就被磷酸化, 其 PTK 活性被激活[3, 19]。Raf/MEK/ERK信號通路調節細胞的增殖、分化和細胞周期進程，是許多上皮性腫瘤增殖的中心調控環節，在許多腫瘤中存在ERK1/2蛋白激活[20-22]。

在本實驗中發現，在低濃度 17β-estrodial的誘導下，SGC7901細胞增殖能力增強(P<0.05)，沉默ER-α36后，這種增強效應消失(P>0.05)。沉默胃癌細胞中ER-α36的表達后， Src、ERK1/2等與細胞增殖相關的信號分子表達也降低，Src蛋白活化能力降低(P<0.05)。提示可能是通過激活Src激酶及細胞內MAPK(ERK1/2)信號通路促進細胞增殖。研究報道，Src及ERK信號通路可以誘導cyclin D1高表達,參與腫瘤細胞增殖[23-24]。

CyclinD1是一種原癌基因，屬于G1細胞周期蛋白家族，通過細胞周期蛋白依賴性激酶4和6的磷酸化和失活Rb蛋白發揮作用，是調控細胞周期G1向S 期轉變的關鍵蛋白，主要功能是促進細胞增殖,同時，研究認為，cyclin D1與雌激素信號通路相關[3, 25]。 在胃癌、食管癌、乳腺癌和尿路上皮癌等多種腫瘤組織中發現有cyclin D1的過表達出現[26-27]。在本實驗中發現，沉默ER-α36后， cyclin D1蛋白表達降低,提示cyclin D1可能參與ER-α36促進細胞增殖的信號通路。

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Construction of lentiviral vector-mediated siRNA knockdown ofER-α36 and its action on gastric cancer cell growth

WANG Xu-ming1, 2, HUANG Xuan1, 2, FU Zheng-qi1, 2, ZOU Feng1, ZHANG Shang-kun1, WANG Zhao-yi1, LIU Li-jiang1, 2

(1DepartmentofPathologyandPathophysiology,SchoolofMedicine，2DepartmentofHistopathology,JiangdaPathologyInstitute,JianghanUniversity,Wuhan430056,China.E-mail:liulijiang@163.com)

AIM: To construct a lentiviral vector for stable delivery of theER-α36 gene and to detect its effect on SGC7901 cell growth. METHODS: The efficient RNAi targeting sequences identified for theER-α36 gene were screened. The Oligo DNA was synthesized with target sequences and annealed to form double-stranded DNA. Then it was digested byXhoI andEcoR I and connected with GV307 vector to produce LV-ER-α36-RNAi lentiviral vector. PCR was used to screen the positive clones and sequence. The LV-ER-α36-RNAi, pHelper 1.0 and pHelper 2.0 plasmids were co-transfected into 293T cells for producing lentiviral vector and infecting SGC7901 cell line. Fluorescence microscopy, real-time PCR and Western blotting were used to detect the transfection efficiency and gene silencing effect. 17β-estrodial at concentration of 1×10-10mol/L was used to stimulate the recombinant cell line, and the action on the growth of gastric cancer cells and the expression of Src, ERK1/2 and cyclin D1 were determined. RESULTS: DNA sequencing analysis confirmed the identity of recombinant shRNA expression vectors. Immunofluorescence assay demonstrated that transfection efficiency was above 80%. Transfection of LV-ER-α36-RNAi significantly knocked down the expression of ER-α36 at mRNA and protein levels with tetracycline (TeT) simulating as revealed by real-time PCR and Western blotting. Compared with control group, the growth of the recombinant cell line declined and the expression of Src, ERK1/2 and cyclin D1 and the activation of Src decreased (P<0.05).CONCLUSION: Lentiviral vectors that silenceER-α36 expression are constructed successfully and can be used to study the role of ER-α36 in gastric cancer. TheER-α36 is related with many kinds of cancer cell growth, including gastric cancer cells.

SGC7901 cells; Estrogen receptorα 36; Lentivirus vector

1000- 4718(2014)12- 2113- 07

2014- 06- 25

2014- 07- 28

國家自然科學基金資助項目(No. 30870981; No. 812727754)

R393； R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2014.12.001

△通訊作者 Tel： 027-84226503； E-mail: liulijiang@163.com