RNA干擾技術沉默CDC25a基因對人肝癌細胞HepG2增殖的影響*

李 薇， 曹 驥， 周玲麗， 羅 旺， 楊 春， 駱成飄， 李 瑗， 蘇建家

(廣西壯族自治區腫瘤防治研究所，廣西 南寧 530021)

RNA干擾技術沉默CDC25a基因對人肝癌細胞HepG2增殖的影響*

李 薇， 曹 驥△， 周玲麗， 羅 旺， 楊 春， 駱成飄， 李 瑗， 蘇建家

(廣西壯族自治區腫瘤防治研究所，廣西 南寧 530021)

目的： 研究細胞分裂周期素25a(cell division cycle 25a，CDC25a)基因沉默后對于人肝癌細胞系HepG2增殖的影響。同時探討該影響發生的可能作用機制。方法: 使用RNA干擾技術沉默人肝癌HepG2細胞的CDC25a基因，采用實時熒光定量PCR技術檢測肝癌細胞中的CDC25a 及其作用基因cyclin E及CDK2的 mRNA表達水平，Western blotting檢測CDC25a的蛋白表達水平，并采用MTT法、Giemsa染色法及流式細胞技術檢測細胞的增殖情況。結果: CDC25a 的mRNA及蛋白表達水平在RNA沉默組細胞中的表達低于陰性對照組及正常對照組細胞(P<0.05)。Cyclin E及CDK2 的mRNA表達水平在沉默組低于陰性對照及正常對照組(P<0.05)。MTT法、Giemsa染色法結果顯示沉默組細胞增殖能力低于陰性對照組及正常對照組細胞(P<0.05)，流式細胞技術結果顯示沉默組細胞阻滯在G1期。 結論: LV-CDC25a-RNAi重組體感染HepG2細胞可以有效抑制CDC25a基因的表達，使人肝癌HepG2細胞增殖受到抑制，提示CDC25a基因可能是肝癌治療的關鍵靶點。

基因，CDC25a； RNA干擾； 肝腫瘤

腫瘤發生是一個多因素、多基因、多步驟累積的過程，最明顯區別于正常組織的是腫瘤細胞的生長具有自主性，即細胞增殖失控。有研究稱幾乎所有癌腫都表現出細胞周期紊亂或不規則，肝癌細胞作為消化系統常見腫瘤同樣也有如此表現。細胞分裂周期素25a(cell division cycle 25a，CDC25a)屬于細胞周期調控蛋白，其作用是活化細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase, CDK)/cyclin這個核心的復合體，因而該基因過度表達可使得細胞加速增殖，一旦平衡失調則會導致腫瘤的發生[1]。本課題組前期研究表明CDC25a蛋白在肝癌組織中呈高表達，并且肝癌患者分期、轉移及復發與該蛋白表達呈正相關[2]。為進一步探討CDC25a基因在肝癌發生及發展中的作用，本實驗采用RNA干擾技術，通過構建靶向CDC25a基因的siRNA慢病毒載體(LV-CDC25a-RNAi)并轉染人肝癌HepG2細胞，將CDC25a基因沉默后觀察該基因對于細胞增殖的影響。

材 料 和 方 法

1 材料

人肝癌HepG2細胞株購自上海吉凱基因技術有限公司；siRNA靶點設計、5種同時帶有綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)、CDC25a基因沉默重組慢病毒顆粒LV-CDC25a-RNAi(KD1、2、3、4、5)及對照慢病毒顆粒(LV-siRNA-NC)的包裝以及嘌呤霉素抗性篩選亦由上海吉凱基因技術有限公司負責；DMEM、胎牛血清和PBS購自Gibco；細胞周期檢測試劑盒、逆轉錄試劑盒購自Fermentas；熒光定量PCR試劑盒購自TaKaRa；噻唑藍(MTT)購自北京鼎國生物技術有限責任公司； Giemsa染液購自美國Chemicon；CDC25a單克隆抗體購自Abcam；鼠抗人GAPDH單克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司；近紅外染料標記的Ⅱ抗購自LI-COR。 Odyssey紅外熒光成像儀為LI-COR產品；酶標儀Elx800購自Biotek；流式細胞儀FACS Calibur為BD產品。

2 方法

2.1 細胞培養、轉染 人肝癌細胞株HepG2置于含10%胎牛血清、1%鹽酸左氧氟沙星的DMEM培養基中培養，在37 ℃、5% CO2條件下進行培養。將對數生長期的人肝癌細胞系HepG2接種于24孔板，每孔種細胞數為1.5×105個；12 h后細胞融合率達到20%左右時進行轉染。轉染的感染復數(multiplicity of infection, MOI)為20，實驗組中分別加入LV-CDC25a-RNAi(KD1、2、3、4、5)， 陰性對照組加入LV-RNAi-NC， 空白對照組不做處理，常規培養。每隔24 h在熒光倒置顯微鏡下觀察熒光表達陽性率。轉染后4～5 d可收獲細胞。

2.2 嘌呤霉素(puromycin)篩選穩定轉染細胞株 使用嘌呤霉素處理HepG2細胞，48 h后細胞全部死亡的最低藥物濃度，即為篩選濃度。實驗組及陰性對照組細胞在轉染48 h后各孔加入含有4 mg/L嘌呤霉素的培養液， 篩選穩定轉染的細胞(實驗過程中設有空白細胞加藥處理組進行對照)， 轉染96 h后換液棄掉無嘌呤霉素抗性的細胞(非穩定轉染細胞)。

2.3 Western blotting檢測CDC25a蛋白表達 使用試劑盒提取7組細胞的總蛋白并用BCA法測定蛋白濃度, 加入蛋白緩沖液，100 ℃變性5 min后放入-80 ℃保存備用。 上樣50 μg, 經SDS-PAGE分離蛋白, 轉膜, 5%脫脂牛奶封閉2 h, 洗膜，加I抗(1∶100)，過夜孵育后洗膜，加II抗(1∶10 000)室溫孵育1 h。采用Odyssey紅外熒光成像儀對PVDF膜進行掃描。

2.4 實時熒光定量PCR檢測CDC25a、cyclin E和CDK2的 mRNA表達水平 使用Primer 5.0軟件設計引物，引物由TaKaRa(大連)合成，CDC25a 上游引物為5’-TTGGTGGATTTTGAAGGT-3’，下游引物為5’-AGTGAAGCCGTGATGGTA-3’，產物大小為233 bp；Cyclin E的上游引物為5’-GACCTAAAGGACTCCCACAACAAC -3’，下游引物為5’-AACGGAGCCCAGAACACCT -3’，產物大小為89 bp；CDK2的上游引物為 5’- ATCCGCCTGGACACTGAG -3’，下游引物為 5’-TCCGCTTGTTAGGGTCGT-3’，產物大小為165 bp；內參照GAPDH的上游引物為 5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’，下游引物為5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’，產物大小121 bp。Trizol法分別提取實驗組、陰性對照及空白對照組細胞總RNA后逆轉錄為cDNA。程序為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，62 ℃或60 ℃ 30 s，共40個循環。每組細胞設計3個重復孔，同時擴增目的及內參照基因。采用2-ΔΔCt分析法計算。

2.5 MTT法分析細胞增殖 取對數生長期3組細胞鋪板，每組5復孔，每孔100 μL(細胞數約為2 000每孔)。分別于種板后的24 h、48 h、72 h、96 h和120 h加入10 μL(5 g/L現配現用)的MTT，無需換液。4 h后加入100 μL DMSO終止反應，振蕩器振蕩5～10 min，酶標儀490 nm檢測吸光度(A)值。

2.6 Giemsa染色檢測克隆形成 取對數生長期細胞以800個每孔將3組細胞接種于6孔板， 設每組3個復孔，置37 ℃、5% CO2培養箱(保證濕度)中培養2周。Giemsa染色，在顯微鏡下計算細胞克隆數。

2.7 細胞周期檢測 取各組對數生長期細胞按105每孔接種于6孔板中，設置4個復孔。各組細胞經胰酶消化后，每管取1×106個細胞；PBS洗細胞3次，離心去上清。70%乙醇固定細胞2 h。離心去固定液，PBS洗滌細胞沉淀1次，每管加入 RNase 37 ℃水浴30 min后加入PI染液。室溫避光孵育30 min；流式細胞儀上機檢測，實驗重復3次。

3 統計學處理

采用SPSS 16.0統計軟件進行分析，計量資料采用均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 判斷慢病毒的感染效率

轉染96 h后熒光最強，在含有不同干擾序列的慢病毒轉染后，各組細胞GFP熒光顯色均勻一致，表達強度無明顯差別，提示各組細胞的慢病毒感染效率無明顯差別，見圖1。

Figure 1.HepG2 cells were infected with the CDC25a-RNAi lentivirus for 96 h (×100).

圖1 CDC25a-RNAi慢病毒感染HepG2細胞

2 CDC25a 的mRNA表達和有效靶點的篩選

Real-time PCR結果顯示，與陰性對照及空白對照組相比，5個靶點中目的mRNA的表達水平均下調約80%左右，差異有統計學意義(P<0.05)，其中以1號靶點敲減效率最高，陰性對照組和空白對照組兩者比較差異無統計學意義，見圖2、表1。

Figure 2.The mRNA expression of CDC25a in control group, NC group and experimental groups. Mean±SD.n=20.*P<0.05vscontrol and NC group.

圖2 CDC25a mRNA在各組細胞中的表達

表1 靶點序列

3 CDC25a蛋白表達水平測定結果

以GAPDH作為內參照，5組慢病毒感染組蛋白相對表達量相比陰性對照組相對表達量分別減少了82.61%±0.24%、77.54%±0.81%、78.26%±0.63%、76.09%±0.79%、76.09%±0.68%， 差異均有統計學意義(P<0.05)，綜合real-time PCR結果可認定LV-CDC25a-RNA(KD1)作為最優靶點，該靶點CDC25a蛋白相對表達量為0.24±0.01，與陰性對照及空白對照組相比，差異有統計學意義(P<0.05)，陰性對照組和空白對照組相比，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖3。

4 Cyclin E及CDK2的 mRNA表達水平測定結果

Real-time PCR結果顯示cyclin E的mRNA表達量LV-CDC25a-RNAi組為0.493±0.160，陰性對照組為1.093±0.250，空白對照組為1.030±0.210；CDK2的mRNA表達量LV-CDC25a-RNAi組為0.654±0.120，陰性對照組為1.030±0.210，空白對照組為0.981±0.140。LV-CDC25a-RNAi組cyclin E及CDK2 的mRNA表達水平均低于陰性對照及空白對照組，差異有統計學意義，陰性對照組和空白對照組兩者比較差異無統計學意義，見圖4。

Figure 3.Western blotting analysis of CDC25a proteins level in control group, NC group and experimental groups. Mean±SD.n= 12.*P<0.05vscontrol group and NC group.

圖3 CDC25a蛋白在各組細胞中的相對表達量

Figure 4.The mRNA expression of cyclin E (A) and CDK2 (B) in control group, NC group and LV-CDC25a-RNAi groups. Mean±SD.n=20.*P<0.05vscontrol group and NC group.

圖4 Cyclin E和CDK2 mRNA的表達量

5 細胞增殖活性結果

與陰性對照及空白對照組相比，轉染后各時段LV-CDC25a-RNAi組細胞490 nm處的A值均下降，但24 h時差異無統計學意義(P>0.05)，其它4個時點差異均有統計學意義(P<0.05)，陰性對照組和空白對照組兩者比較差異無統計學意義，見圖5。

Figure 5.MTT analysis of the cell proliferation in control group, NC group and LV-CDC25a-RNAi groups. Mean±SD.n=20.*P<0.05vscontrol group and NC group.

圖5 MTT法檢測3組細胞的活力

6 各組細胞克隆數比較

Giemsa染色法檢測結果為LV-CDC25a-RNAi組低于陰性對照組及空白對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；空白對照組與陰性對照組比較，差異無統計學意義，見圖6。

Figure 6.Giemsa staining shows the clones in each groups. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol group and NC group.

圖6 吉姆薩染色法顯示3組細胞的克隆數

7 各組細胞的細胞周期檢測結果(流式細胞術)

實驗結果顯示LV-CDC25a-RNAi組的G1期比例比陰性對照及空白對照組G1期比例升高(P<0.05)；LV-CDC25a-RNAi組G2期比例比陰性對照及空白對照組G2期比例降低(P<0.05)；LV-CDC25a-RNAi組S期比例比陰性對照及空白對照組S期比例降低(P<0.05)，3個時期各組細胞間的差異均有統計學意義，陰性對照組和空白對照組對比兩者差異無統計學意義(P>0.05)，見圖7。

Figure 7.Flow cytometry analysis of the cell cycle in control group, NC group and LV-CDC25a-RNAi groups. Mean±SD.n=20.*P<0.05vscontrol group and NC group.

圖7 流式細胞術檢測各組細胞的細胞周期比例

討 論

CDC25基因所表達的蛋白CDC25磷酸酶，屬于細胞周期調控蛋白，主要分為CDC25a、CDC25b、CDC25c 3種。CDC25a作用于cyclin A/CDK2和cyclin E/CDK2，促進細胞從G1進入S期[3]。有實驗顯示，將CDC25a抗體顯微注射到增殖細胞中，可將增殖細胞阻滯在G1期[4]，提示CDC25a在G1/S期細胞周期進程中有顯著作用。另有研究認為，CDC25a在細胞凋亡中的作用存在差異，在胞質中主要起到抑制細胞凋亡的作用，而在胞核中則起到促進凋亡的作用，總的來說，其作用主要以抑制凋亡為主[5]。CDC25a在許多類型的癌癥中過度表達，如乳腺癌、肺癌、卵巢癌、結腸癌及非霍奇金性淋巴瘤等[5-9]。Demidova等[10]發現CDC25a的過度表達可能是p53基因突變的結果。

Xu等[11]發現在肝細胞癌中CDC25a基因同樣為過度表達狀態；郭艷等[12]研究發現CDC25a基因可能在肝癌的發生及轉移過程中發揮重要作用，肝癌組織中CDC25a基因的表達與超聲影像相結合可為肝癌臨床治療及預后判斷提供理論依據。本課題組前期研究發現CDC25a不僅在人肝癌組織中呈現高表達，在大鼠及樹鼩肝癌模型中同樣為高表達狀態，提示CDC25a表達水平的改變在肝癌的發生發展中起到重要的作用[2]。本實驗中我們設計合成了CDC25a小分子干擾RNA，利用慢病毒作為載體，將含有CDC25a小分子干擾RNA的質粒轉染至人肝癌HepG2細胞中。通過real-time PCR及Western blotting實驗檢驗CDC25a基因被敲減的效果，并篩選出相對于陰性對照及空白對照組來說沉默效率最高的1號靶點。將1號靶點為最佳靶點轉染細胞并大量培養，進行后續的細胞功能實驗。MTT實驗結果顯示，實驗組增殖活力明顯低于陰性對照及空白對照組，表明CDC25a沉默后的細胞增殖能力下降；Giemsa染色法檢測提示轉染后的細胞克隆能力比陰性對照及空白對照組的細胞弱；流式細胞術結果則顯示細胞被滯留于G1期，提示細胞增殖受到抑制。

上述細胞功能實驗結果顯示，RNA干擾CDC25a基因后肝癌細胞的周期受到阻滯，細胞停留在G1期無法進入S期進行增殖，其增殖功能受到明顯抑制。有學者[15]提出CDC25a可作為癌癥藥物的一個潛在靶點[13-14]，2008年有學者提出可以將CDC25a作為肝癌藥物治療的靶點。肝癌作為常見的消化系統腫瘤，具有發現晚，死亡率高的特點，治療手段主要以早期手術治療為主。目前國內尚無沉默肝癌細胞中的CDC25a基因并觀察沉默細胞增殖能力變化這方面的研究，本實驗從內源性將肝癌細胞中的CDC25a基因沉默并后續進行沉默細胞的增殖能力檢測，其結果為CDC25a基因成為肝癌藥物治療的一個有效靶點提供更加有利的依據。

[1] Shen T, Huang S. The role of Cdc25A in the regulation of cell proliferation and apoptosis[J]. Anticancer Agents Med Chem, 2012, 12(6):631-639.

[2] 盧曉旭，曹 驥，李 瑗，等．CDC25a在跨種屬肝癌組織中的表達及其意義[J]. 中國病理生理雜志，2014，30(5):820-824．

[3] Krauss G. Biochemistry of signal transduction and regulation[M]．第3版．北京：化學工業出版社，2005.321-324．

[4] Hoffmann I, Draetta G, Karsenti E. Activation of the phosphatase activity of human Cdc25A by a CDK2-cyclin E dependent phosphorylation at the G1/S transition[J]. EMBO J, 1994, 13(18):4302-4310.

[5] Leisser C, Rosenberger G, Maier S, et al. Subcellular localization of Cdc25A determines cell fate[J]. Cell Death Differ, 2004, 11(1):80-89.

[6] Brunetto E1, Ferrara AM, Rampoldi F, et al. CDC25A protein stability represents a previously unrecognized target of HER2 signaling in human breast cancer: implication for a potential clinical relevance in trastuzumab treatment[J]. Neoplasia, 2013, 15(6):579-590.

[7] Ma H, Chen J, Pan S, et al. Potentially functional polymorphisms in cell cycle genes and the survival of non-small cell lung cancer in a Chinese population[J]. Lung Cancer, 2011, 73(1):32-37.

[8] Cruz-Bravo RK, Guevara-González RG, Ramos-Gómez M, et al. The fermented non-digestible fraction of common bean (Phaseolus vulgaris L) triggers cell cycle arrest and apoptosis in human colon adenocarcinoma cells[J]. Genes Nutr, 2014, 9(1):359.

[9] Aref S, Fouda M, El-Dosoky E, et al. c-Myc oncogene and Cdc25A cell activating phosphatase expression in non-Hodgkin’s lymphoma[J]. Hematology, 2003, 8(3):183-190.

[10]Demidova AR, Aau MY, Zhuang L, et al. Dual regulation of Cdc25A by Chk1 and p53-ATF3 in DNA replication checkpoint control[J]. J Biol Chem, 2009, 284(7):4132-4139.

[11]Xu X,Yamamoto H, Sakon M, et al. Overexpression of Cdc25A phosphatase is associated with hypergrowth activity and poor prognosis of human hepatocellular carcinomas[J]. Clin Cancer Res, 2003, 9(5):1764-1772.

[12]郭 艷，王 茜，楊志杰．原發性肝細胞癌CDC25A的表達與多普勒超聲影像特征的關聯性分析[J]．世界華人消化雜志，2013，21(26):2649-2654．

[13]Lazo J, Wipf P. Is Cdc25 a druggable target[J]. Anticancer Agents Med Chem, 2008, 8(8):837-842.

[14]Lavecchia A, Di Giovanni C, Novellino E. Cdc25A and B dual-specificity phosphatase inhibitors: potential agents for cancer therapy[J]. Curr Med Chem, 2009, 16(15):1831-1849.

[15]Xu X, Yamamoto H, Liu G, et al. CDC25A inhibition suppresses the growth and invasion of human hepatocellular carcinoma cells[J]. Int J Mol Med, 2008, 21(2): 145-152.

Effects of RNA interference targetingCDC25agene on proliferation of human liver cancer HepG2 cells

LI Wei, CAO Ji, ZHOU Ling-li, LUO Wang, YANG Chun, LUO Cheng-piao, LI Yuan, SU Jian-jia

(InstituteforTreatmentandPreventionofTumor,GuangxiZhuangAutonomousRegion,Nanning530021,China.E-mail:caojicn@163.com)

AIM: To investigate the effect of silencing cell division cycle 25a (CDC25a) gene on the proliferation of human hepatoma HepG2 cells. METHODS:CDC25agene in human hepatoma HepG2 cells was silenced by RNA interference. Real-time PCR was applied to detect the expression of CDC25a, cyclin E and CDK2 at mRNA levels in the HepG2 cells. Western blotting was applied to detect the expression of CDC25a at protein level. In addition, MTT assay, Giemsa staining and flow cytometry were used to measure the proliferation of human hepatoma HepG2 cells. RESULTS: The expression of CDC25a at mRNA and protein levels in RNA silence group was lower than those in negative control group and normal control group (P<0.05). The mRNA expression of cyclin E and CDK2 in silence group was lower than that in negative control group and normal control group (P<0.05). The cell proliferation in silence group was lower than that in negative control group and normal control group (P<0.05). The results of flow cytometry revealed that the cells in silence group were blocked in G1phase. CONCLUSION: Infection of LV-CDC25a-RNAi recombinant to the HepG2 cells effectively inhibits theCDC25agene expression and the proliferation of human hepatoma cells, and arrests the cells in G1phase, suggesting thatCDC25agene may be a key target for the treatment of liver cancer.

Genes,CDC25a; RNA interference; Liver neoplasms

1000- 4718(2014)12- 2142- 06

2014- 07- 24

2014- 10- 31

國家自然科學基金資助項目(No. 30960428)； 廣西科技基礎條件平臺建設項目(No. 10-108-25)； 廣西科學基金資助項目(No. 2013GXNSFAA019210)

R73-3

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2014.12.005

△通訊作者 Tel: 0771-5310593； E-mail: caojicn@163.com