舒林酸對丙戊酸孤獨癥動物模型大鼠氧化應激變化的影響*

張應花， 楊彩玲， 崔衛剛， 王中平， 文小軍， 李瑞錫

(1新鄉醫學院解剖教研室，河南 新鄉 453003； 2新鄉醫學院第一附屬醫院口腔頜面外科，河南 衛輝 453100；3復旦大學上海醫學院人體解剖與組織胚胎學系，上海 200032； 4九江學院基礎醫學院生理學與病理生理學教研室，江西 九江 332000)

舒林酸對丙戊酸孤獨癥動物模型大鼠氧化應激變化的影響*

張應花1△， 楊彩玲2， 崔衛剛3, 1， 王中平3, 4， 文小軍1， 李瑞錫3

(1新鄉醫學院解剖教研室，河南 新鄉 453003；2新鄉醫學院第一附屬醫院口腔頜面外科，河南 衛輝 453100；3復旦大學上海醫學院人體解剖與組織胚胎學系，上海 200032；4九江學院基礎醫學院生理學與病理生理學教研室，江西 九江 332000)

目的： 探討舒林酸對孤獨癥發生過程中氧化應激變化的影響。方法: 利用丙戊酸(VPA)孤獨癥動物模型，檢測經典Wnt信號通路特異性抑制劑舒林酸處理后經典Wnt信號通路及氧化應激標志物在孤獨癥模型大鼠前額葉皮質及海馬腦區的表達變化。Western blotting法檢測糖原合成激酶3β(GSK-3β)、β-catenin和4-羥基壬烯醛(4-HNE)表達，半定量RT-PCR法檢測硫氧還蛋白(Trx)1和Trx2 mRNA表達。結果: 與對照組相比，在前額葉皮質及海馬腦區VPA組GSK-3β蛋白表達減少，Trx1和Trx mRNA 表達減少，β-catenin與4-HNE的表達增加；而與VPA組相比，VPA與舒林酸同時處理組GSK-3β的表達顯著增加，β-catenin和4-HNE的表達顯著減少。結論: 舒林酸減少了孤獨癥發生過程中氧化應激的產生，提示經典Wnt信號通路上調導致氧化應激產生，進而導致孤獨癥易感性增加。

孤獨癥； Wnt/β-catenin通路； 丙戊酸； 舒林酸； 氧化應激

孤獨癥(autism)是一種嚴重的神經發育障礙性疾病。多數患兒有明顯的語言交流艱難、社會交往障礙和重復刻板行為三大核心表現，臨床上稱為“Kanner三聯征”。然而，目前孤獨癥的病因尚不清楚，對其發生、發展機制知之甚少。據報道，孤獨癥發生可能與 Wnt 信號通路傳導異常有關。敲除了該通路信號分子Dvl1 基因的小鼠表現出孤獨癥樣的社會行為異常，提示Wnt信號通路可能與孤獨癥發病有關[1]。近年來，我們課題組檢測到孤獨癥模型大鼠存在 Wnt信號通路中關鍵信號蛋白表達異常[2-3]，同時采用表觀遺傳學技術研究發現，孤獨癥大鼠動物模型腦內存在去甲基化水平升高[2]，提示 Wnt信號通路機能亢進。Wnt信號通路下調可以導致神經元凋亡[4]，而Wnt信號通路上調可誘導細胞增殖[5]，進而可導致巨大腦和腦皮質容量增加，這可能與孤獨癥腦早期的過度增生有關。以上這些資料表明孤獨癥發生與經典Wnt信號通路傳導異常有關。

近年來研究顯示孤獨癥患者存在氧化穩態的異常[6-7]。氧化應激是由自由基在體內產生的一種負面作用，是導致孤獨癥患者腦區蒲肯野細胞缺失和存在其它神經解剖學異常的一個重要因素[8]。Wnt 信號通路與氧化應激是否存在關聯呢？Wnt 信號通路的一個分泌性抑制劑DKK1高表達可以減少類脂的聚集[9]，增加氧化應激產生的活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平[10]。乙醇可以誘導產生氧化應激，導致 Wnt 信號通路許多組成分子下調；但是與抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine， NAC) 共處理以后，乙醇的上述作用被減弱[11]。這就提示乙醇誘導氧化應激是通過下調Wnt信號通路發揮作用的。在孤獨癥發生過程中Wnt信號通路與氧化應激的關系如何呢？丙戊酸(valproic acid，VPA)作為一種環境因素，導致子代孤獨癥的發生，這是否與調控個體發育的經典Wnt信號通路傳導障礙，進而誘導氧化穩態的異常從而導致孤獨癥的發生有關呢？因此，本研究旨在探索孤獨癥發生過程中經典Wnt信號通路與氧化應激的關系，揭示孤獨癥發生的可能機制。

材 料 和 方 法

1 實驗動物和材料

健康成年 Wistar 雄性(300～350 g)及雌性(200～250 g)大鼠，購自中國科學院(上海)實驗動物部，飼養于復旦大學人體解剖與組織胚胎學系專用動物房，給予充分的飼料和飲水。所有實驗動物喂養及實驗程序均嚴格遵照復旦大學實驗動物保護條款。

VPA和舒林酸(sulindac)購自Sigma；兔抗糖原合成激酶3β(glycogen synthase kinase 3β， GSK-3β)抗體購于Cell Signaling Technology；兔抗β-catenin抗體購于Santa Cruz；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的山羊抗兔IgG購于Jackson；小鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)單克隆抗體、蛋白酶抑制劑購于康成公司；cDNA逆轉錄試劑盒購自TaKaRa；2× PCR Mix購自Invitrogen。引物由上海生工生物技術服務有限公司合成。

2 方法

2.1 孤獨癥大鼠模型建立及實驗分組 實驗前大鼠在周期性光照(7:00 AM～7:00 PM)、恒溫25 °C和恒濕55%條件下飼養1周，使之適應環境。然后，按雌∶雄 2∶1 合籠過夜。第二天早晨，檢查到陰栓的雌鼠記為胚胎第1 天(embryoic day 1，E1)，然后受孕鼠分籠單獨飼養。將受孕母鼠隨機分成3組：模型組(VPA組)5只，在E12.5時給予母鼠腹腔注射600 mg/kg VPA；處理組(VPA+sulindac組)6只，在母鼠注射VPA后30 min給予5 mg/kg舒林酸；對照組(control組)4只，給予母鼠注射同等量的生理鹽水。各組母鼠產下的幼鼠，按照與母鼠對應的分組各取8只。

2.2 孤獨癥模型動物生長發育和行為學檢測 參照 Schneider 等[12]所建立的方法并稍作改進，模型組和對照組幼鼠各6只進行生長發育與行為學檢測。觀察幼鼠出生后12、13、14、15和16 d的睜眼情況(0分：2只眼睛均未睜；1分：1只眼睛睜開；2分：2只眼睛都睜開)。出生后9、11、13和15 d的幼鼠進行游泳測驗，把幼鼠逐個單獨放于28 °C的恒溫槽中央，觀察5～10 s，根據動物耳朵與頭頂部處于水面的位置評分(0分：頭頂和鼻子都在水面以下；1分：鼻子在水面以下，頭頂在水面以上；2分：鼻子和頭頂在水面以上或者與水面平齊而雙耳在水面以下；3分：鼻子和頭頂的位置與2分標準相同，但水位線在耳朵中間；4分：鼻子和頭頂的位置與2分標準相同，要求水位線在耳朵以下)。

2.3 半定量RT-PCR檢測硫氧還蛋白(thioredoxin,Trx)1和Trx2 mRNA水平的表達 用Trizol提取大鼠前額葉皮質(prefrontal cortex，PFC)及海馬(hippocampus，HC)腦組織總RNA。A260/A280比值在1.8～2.0之間。根據大鼠GenBank的基因序列使用Primer Design軟件進行引物設計。具體序列如下：Trx1的上游引物為5’-TTCTTTCATTCCCTCTGTG-3’，下游引物為5’-TCCGTAATAGTGGCTTCG-3’；Trx2的上游引物為5’-GGGCTTCCCTCACCTCTA-3’， 下游引物為5’-TGTTTGGCTACCATCTTCTC-3’；GAPDH的上游引物為5’-TATCGGACGCCTGGTTAC-3’， 下游引物為5’-TGCTGACAATCTTGAGGGA-3’。RT-PCR按照說明書進行操作；反應條件為：95 °C 5 min，然后95 °C 30 s，57 °C 30 s，72 °C 30 s,擴增30循環，最后72 °C 10 min。PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，在Runone DNA電泳系統中進行，用數字成像系統分析圖像，以目的基因灰度與內參基因灰度比值代表目的基因的相對表達量。

2.4 Western blotting檢測GSK-3β、β-catenin和4-羥基壬烯醛(4-hydroxynonenal，4-HNE)的表達 處理組、模型組和對照組冰上取全腦并分離出PFC及HC，用蛋白裂解液提取相應組織總蛋白質，用BCA法測定樣品的蛋白濃度。加入5×上樣緩沖液后，100 °C加熱變性3 min。用12% 十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfonate，SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)中分離蛋白，后轉移到膜上，5%牛血清白蛋白TBST搖床常溫封閉2 h。加I抗，4 °C搖床過夜；加II抗和GAPDH搖床常溫2 h，ECL發光顯色，然后將PVDF膜置于Bio-Rad的顯影機上，獲取反應條帶的數字圖并將條帶進行灰度測定，以目的蛋白和內參照GAPDH蛋白的灰度比值代表目的蛋白的相對表達量。

3 統計學處理

計量數據用均數±標準差(mean±SD)表示，用 SPSS 16.0統計軟件進行分析，分別對4-HNE及Trx1、Trx2 的mRNA在模型組和對照組中的相對表達定量值采用t檢驗，GSK-3β、β-catenin和4-HNE在處理組、模型組和對照組3組蛋白相對表達量比較采用單因素方差分析(ANOVA)，進一步兩兩比較采用LSD法。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 孤獨癥模型動物生長發育及行為學檢測比較

睜眼情況評分顯示，睜眼時間有顯著差異(P<0.01)；其中模型組較對照組睜眼時間晚，模型組與對照組相比，在出生后 13 d差異有統計學意義，出生后12、14、15 和16 d無顯著差異。游泳行為測試結果顯示，游泳評分有顯著差異(P<0.05)；其中模型組大鼠的游泳能力比對照組明顯低下，在出生后9和11 d差異有統計學意義(P<0.01);至出生后13 d，能力有所提高，但與對照組相比差異無統計學意義;而發育到出生后15 d，游泳能力進一步提高,見表1。上述結果表明，以這些模型動物為實驗對象，做后續實驗是可靠的。

表1 孤獨癥模型睜眼和方位趨向感覺發育情況評估

PND:postnatal day.*P<0.05vscontrol.

2 孤獨癥大鼠氧化應激標志物4-HNE、Trx1和Trx2的表達變化

模型組PFC及HC組織的4-HNE蛋白表達高于對照組(P<0.05)；而模型組Trx1和Trx2 mRNA的表達低于對照組，差異均有統計學意義,見圖1、2和表2。

Figure 1.The protein expression of 4-HNE in PFC and HC tissues of control and autism rats.

圖1 4-HNE在模型鼠與對照組大鼠PFC及HC腦區中的表達

Figure 2.The mRNA expression of Trx1 and Trx2 in PFC and HC tissues of control and autism rats.

圖2 Trx1及Trx2的mRNA在模型鼠與對照組大鼠PFC及HC腦區的表達

TableP<0.05vscontrol.

3 舒林酸處理后孤獨癥大鼠經典Wnt信號通路的變化

Western blotting結果顯示，3組PFC及HC組織的GSK-3β蛋白表達有顯著差異，其中處理組高于模型組，差異均有統計學意義，模型組GSK-3β蛋白的表達低于對照組，差異有統計學意義。3組PFC及HC組織的β-catenin蛋白表達有顯著差異，處理組低于模型組，差異有統計學意義，而模型組高于對照組，差異有統計學意義,見圖3、表3。

Figure 3.The protein expression of GSK-3β and β-catenin in PFC and HC in the rats of 3 groups.

圖3 GSK-3β及β-catenin 蛋白在處理組、模型組與對照組大鼠PFC及HC腦區表達的變化

4 舒林酸處理后孤獨癥大鼠氧化應激的變化

結果顯示，3組PFC及HC組織4-HNE的表達有顯著差異，其中處理組低于模型組，而4-HNE的表達模型組高于對照組(均P<0.05)，見圖4、表3。

Figure 4.The expression of 4-HNE in PFC and HC of the rats in 3 groups.

圖4 Sulindac處理后4-HNE在三組大鼠PFC及HC腦區中的表達

討 論

本實驗研究發現，舒林酸處理后經典Wnt通路功能減弱，基于GSK-3β 表達增加，β-catenin表達減少。舒林酸下調經典Wnt信號通路活性同時，氧化應激標志物4-HNE表達減少。這些結果表明舒林酸減少孤獨癥發生過程中氧化應激的產生，提示經典Wnt信號通路上調導致氧化應激產生，進而可能導致孤獨癥易感性增加。出生前或出生后環境因素，如VPA暴露可能會引起ROS產生[8]。ROS會干擾神經發育進程，或者導致神經中樞損傷，可能會導致行為學出現異常。這也暗示人體，特別是遺傳易感兒童發育關鍵時期環境毒物，如VPA暴露導致遺傳改變的可能機制就是氧化應激的存在。本研究結果顯示，VPA孤獨癥模型動物的確存在氧化應激，基于4-HNE產生增加及Trx1、Trx2 的mRNA表達減少。但是有報道指出VPA并不影響氧化DNA損傷標志物8-OHdG、蛋白硝基化作用標記物3-NT和4-HNE的表達[13]，這與本實驗結果并不一致。可能是由于使用的VPA濃度不同，或者與分布結構對氧化應激是否敏感有關。減少氧化應激可能可以預防或至少減緩孤獨癥的發生。但是因為氧化應激在許多病理情況下都存在，所以孤獨癥的發生可能是由于其它參與該病發生的因素，如經典Wnt信號通路對氧化應激作用所導致的。的確，本實驗結果顯示，舒林酸作為經典Wnt信號通路的特異性抑制劑[14]，下調經典Wnt信號通路的同時，減少氧化應激產生，這可能與其具有減少細胞色素P450、具有抗氧化性質有關[15]。

表3 GSK-3β、β-catenin和4-HNE蛋白在大鼠PFC及HC腦區的表達

TableP<0.05vscontrol；#P<0.05vsVPA.

綜上所述，經典Wnt信號通路特異性抑制劑舒林酸能減少氧化應激發生，這就提示經典Wnt信號通路誘導氧化應激的發生可能導致患孤獨癥易感性增加，同時也提示舒林酸的抗氧化性質有可能對孤獨癥的產生有預防作用。鑒于動物模型的局限性，該結論擴展到孤獨癥患者需謹慎。而且對于神經發育障礙性疾病孤獨癥來說，探討不同年齡階段使用舒林酸對其氧化應激的影響可能較一個橫斷面的研究更有意義，尤其利用孤獨癥模型動物在早期干預期進行相關研究，可能更有臨床意義。

[1] Lijam N,Paylor R, McDonald MP, et al. Social interaction and sensorimotor gating abnormalities in mice lacking Dvl1[J]. Cell, 1997, 90(5):895-905.

[2] Wang Z, Xu L, Zhu X, et al. Demethylation of specific Wnt/beta-catenin pathway genes and its upregulation in rat brain induced by prenatal valproate exposure[J]. Anat Rec (Hoboken), 2010, 293(11):1947-1953.

[3] Zhang Y, Sun Y, Wang F, et al. Downregulating the canonical Wnt/beta-catenin signaling pathway attenuates the susceptibility to autism-like phenotypes by decreasing oxidative stress[J]. Neurochem Res, 2012, 37(7):1409-1419.

[4] 楊 雁, 張曉潔, 王玉萍, 等. 噻唑烷二酮通過Wnt通路改善2型糖尿病大鼠海馬阿爾茨海默病樣病變[J]. 中國病理生理雜志, 2010, 26(12):2421-2427.

[5] 李海英, 張 力, 潘歡樂, 等. Wnt信號通路在食管癌細胞放射抗拒性形成中的作用[J]. 中國病理生理雜志, 2012, 28(9):1623-1626.

[6] Ghezzo A, Visconti P, Abruzzo PM, et al. Oxidative stress and erythrocyte membrane alterations in children with autism: correlation with clinical features[J]. PLoS One, 2013, 8(6):e66418.

[7] Gu F, Chauhan V, Kaur K, et al. Alterations in mitochondrial DNA copy number and the activities of electron transport chain complexes and pyruvate dehydrogenase in the frontal cortex from subjects with autism[J]. Transl Psychiatry, 2013, 3:e299.

[8] Sandhya T, Sowjanya J, Veeresh B.Bacopamonniera(L.) Wettst ameliorates behavioral alterations and oxidative markers in sodium valproate induced autism in rats[J]. Neurochem Res, 2012, 37(5):1121-1131.

[9] Strakovsky RS, Pan YX. A decrease in DKK1, a WNT inhibitor, contributes to placental lipid accumulation in an obesity-prone rat model[J]. Biol Reprod, 2012, 86(3):81.

[10]Park JW, Kuehn HS, Kim SY, et al. Downregulation of Wnt-mediated ROS generation is causally implicated in leprechaunism[J]. Mol Cells, 2010, 29(1):63-69.

[11]Chen JR, Lazarenko OP, Shankar K, et al. A role for ethanol-induced oxidative stress in controlling lineage commitment of mesenchymal stromal cells through inhibition of Wnt/beta-catenin signaling[J]. J Bone Miner Res, 2010, 25(5):1117-1127.

[12]Schneider T, Turczak J, Przewlocki R. Environmental enrichment reverses behavioral alterations in rats prenatally exposed to valproic acid: issues for a therapeutic approach in autism[J]. Neuropsychopharmacology, 2006, 31(1):36-46.

[13]Tung EW, Winn L. Valproic acid increases formation of reactive oxygen species and induces apoptosis in postimplantation embryos: a role for oxidative stress in valproic acid-induced neural tube defects[J]. Mol Pharmacol, 2011, 80(6):979-987.

[14]Huang Y, Chang X, Lee J, et al. Cigarette smoke induces promoter methylation of single-stranded DNA-binding protein 2 in human esophageal squamous cell carcinoma[J]. Int J Cancer, 2011, 128(10):2261-2273.

[15]Bass SE, Sienkiewicz P, Macdonald CJ, et al. Novel dithiolethione-modified nonsteroidal anti-inflammatory drugs in human hepatoma HepG2 and colon LS180 cells[J]. Clin Cancer Res, 2009, 15(6):1964-1972.

Effects of sulindac on oxidative stress in an autistic model induced by prenatal exposure to valproic acid

ZHANG Ying-hua1, YANG Cai-ling2, CUI Wei-gang3, 1, WANG Zhong-ping3, 4， WEN Xiao-jun1, LI Rui-xi3

(1DepartmentofHumanAnatomy,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453003,China;2DepartmentofOralandMaxillofacialSurgery,TheFirstAffiliatedHospital,XinxiangMedicalUniversity,Weihui453100,China;3DepartmentofAnatomy,HistologyandEmbryology,ShanghaiMedicalCollege,FudanUniversity,Shanghai200032,China;4DepartmentofPhysio-logyandPathophysiology,SchoolofBasicMedicalSciences,JiujiangUniversity,Jiujiang332000,China.E-mail:zyhflo2013@163.com)

AIM: To investigate the effects of sulindac on oxidative stress in autism. METHODS: With an autistic model induced by prenatal exposure to valproic acid (VPA), we detected the expression of the signaling molecules of canonical Wnt pathway in the prefrontal cortex (PFC) and hippocampus (HC) of autistic rats treated with sulindac. The protein expression levels of glycogen synthase kinase 3β (GSK-3β), β-catenin and 4-hydroxynonenal (4-HNE) were observed by Western blotting. The mRNA expression of thioredoxin(Trx)1 and Trx2 was assessed by semi-quantitative RT-PCR.RESULTS: The protein level of GSK-3β and mRNA levels of Trx1 and Trx2 were lower, whereas the protein expression levels of β-catenin and 4-HNE were higher in VPA group than those in control group. In contrast, the protein levels of GSK-3β were significantly higher in the animals treated with both VPA and sulindac than those in VPA group, while the levels of β-catenin and 4-HNE were decreased.CONCLUSION: Sulindac attenuates oxidative stress in the pathogenesis of autism, suggesting the up-regulation of the Wnt/β-catenin signaling pathway disrupts oxidative homeostasis and further facilitates susceptibility to autism.

Autism; Wnt/β-catenin pathway; Valproic acid; Sulindac; Oxidative stress

1000- 4718(2014)12- 2161- 05

2014- 07- 04

2014- 09- 09

國家自然科學基金資助項目(No.81301174; No.81260211)；新鄉醫學院博士科研啟動基金資助項目(No.505003)

R363.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2014.12.008

△通訊作者 Tel： 0373-3029051； E-mail： zyhflo2013@163.com