三七總皂苷對大鼠腹部游離皮瓣存活的影響

王 智，郅克謙，許志鵬，張瑞智

·論著·

三七總皂苷對大鼠腹部游離皮瓣存活的影響

王 智1a，郅克謙1b*，許志鵬2，張瑞智3

目的 觀察三七總皂苷對大鼠腹部游離皮瓣氧化應激、血液流變學以及皮瓣存活率的影響，初步探討三七總皂苷影響皮瓣存活的可能機制。方法 健康清潔雄性SD大鼠144只，隨機平均分為假手術組(SO組)，缺血再灌注組(IR組)和三七總皂苷干預組(PNS組)。建立大鼠右下腹部游離皮瓣模型。在術前30 min分別給予生理鹽水(SO組、IR組)、三七總皂苷注射液(PNS組)腹腔注射，一次性給藥。術后檢測各組大鼠血液中丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性及血液流變學指標，并觀察皮瓣成活率。結果 IR組、PNS組于皮瓣組織再灌注后(即血管吻合成功后)4、8、24 h 3個時點，MDA含量均高于SO組，SOD活性及血液流變學指標則低于SO組(P<0.05)；同時，PNS組在這3個時點的各項指標又優于IR組(P<0.05)。皮瓣成活率為：缺血再灌注組<三七總皂苷組<假手術組(P<0.01)。結論 三七總皂苷能通過改善微循環和提高機體抗氧化的能力，促進皮瓣成活。

游離皮瓣；氧化應激；血液流變學；三七總皂苷

0 引言

在整形和顯微外科等領域，由于游離皮瓣能夠較大距離轉移，修復面積較大，因此，經常被應用于腫瘤切除、創傷、慢性潰瘍或其他疾病造成的軟組織缺損的修復重建中，以達到創面修復、功能重建及形態恢復的目的。但在游離皮瓣遠位移植后，各種原因引起的皮瓣部分或全部壞死嚴重影響了組織缺損區外觀的改善和功能重建。現有研究認為，移植后的皮瓣血供單一、側支循環缺乏造成的局部組織缺血、缺氧，血液循環障礙尤其是微循環障礙導致皮瓣的局部缺血、瘀血、血栓形成等是導致皮瓣部分或全部壞死的始動因素[1]。值得關注的是近年來研究表明，皮瓣缺血、缺氧造成的局部組織內環境紊亂、氧自由基所致的脂質過氧化、細胞內鈣超載，也是影響皮瓣成活的重要因素[2]。因此，如果能在游離皮瓣移植后，利用某些影響因素減輕微循環障礙和缺血再灌注損傷，防止皮瓣壞死和提高移植成活率，將對臨床改善皮瓣修復術后患者的預后有著極為重要的意義。

三七總皂苷(Panax notoginseng saponins，PNS)具有多種生物學活性和藥理作用，相關研究表明其能清除自由基，防止脂質過氧化損傷，松弛血管平滑肌而緩解微動脈痙攣、降低微小血管阻力、減輕血管內皮損傷；抑制血小板聚集、抗凝血、改善血液流變學特征[3]。本實驗建立大鼠腹部游離皮瓣模型，觀察不同時段各組皮瓣的血液流變學、生化指標的變化，探討三七總皂苷對游離皮瓣成活的影響及作用機制，為臨床防治皮瓣壞死提供客觀的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 選用雄性清潔級SD大鼠144只，鼠齡80 d左右，體重(340±20) g，由西安交通大學醫學院動物實驗中心提供。術前在恒濕恒溫環境下飼養1周，手術前12 h禁飲食。注射用三七總皂苷(購自昆明興中制藥有限責任公司)，超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)檢測試劑盒(購自上海普林斯頓生物科技發展有限公司)，北京中勤世帝LG-R-80A血液黏度儀(由本院檢驗科提供)。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組 144只大鼠隨機平均分為假手術組(SO組)，缺血再灌注組(IR組)和三七總皂苷干預組(PNS組)，每組48只。其中，每組隨機選取8只大鼠用于檢測皮瓣成活率，剩余40只大鼠再按皮瓣組織取材的5個相應時間點即切斷股動靜脈前、再灌注前(即血管吻合成功前)、再灌注后(即血管吻合成功后)4、8、24 h分成5個亞組(分別計為T1～5)，每組8只。

1.2.2 模型制備 參照Ozkan[4]方法，在各組大鼠右下腹部設計一塊大小為4.0 cm×3.0 cm游離皮瓣(皮瓣的蒂部靠近腹股溝)，此皮瓣的血供主要由股動、靜脈分支的腹壁淺動、靜脈供應。消毒后沿設計線切至腹外斜肌肌膜淺層，自頭端向尾端鈍性分離皮瓣，分離出股動、靜脈主干及腹壁淺動、靜脈，結扎并剪斷股動、靜脈遠端，保留接連皮瓣的腹壁淺動、靜脈作為蒂部相連，以保證其為惟一的血供。SO組：游離皮瓣制備完成后原位縫合，不做任何處理；IR、PNS組：仔細分離近心端股動靜脈；于股動靜脈發出腹壁淺動、靜脈處上方1.0 cm左右上微血管夾并切斷股動、靜脈，兩斷端先后用肝素、利多卡因、生理鹽水沖洗后，在外科顯微鏡下以11/0無創縫合線依次吻合股靜脈及股動脈，松開微血管夾，確認腹壁淺血管血流恢復、皮瓣顏色逐步紅潤為血管吻合成功(吻合時間不超過2 h)，最后原位縫合皮瓣。

1.2.3 給藥方法 術前30 min，SO組和IR組腹腔注射生理鹽水4 mL/kg，PNS組分別腹腔注射三七總皂苷40 mg/kg，注射點避開皮瓣，給藥位置達皮瓣正下方。

1.2.4 取材和處理 各實驗組所分亞組內的共120只大鼠按如前所述T1～55個相應時間點，分別于皮瓣近蒂處取成活的全層皮瓣組織一塊，大小約1.0 cm×0.5 cm×0.2 cm，于-85 ℃冰箱留存待做生化檢測。各亞組大鼠在完成皮瓣組織取材同時，從股動脈中抽全血5 mL，置于肝素鈉抗凝管，立即進行血液流變學檢測。

1.2.5 觀察指標 (1)皮瓣成活率：術后第7 d觀察三組先前確定的24只大鼠腹部皮瓣情況，以皮瓣呈粉紅色，觸之柔軟，彈性較好認為成活；以皮瓣失去彈性，大部分呈灰黑色結痂認為壞死。用數碼相機對24只大鼠皮瓣拍照后，采用Leica Q 550 CW計算機圖像信號采集與分析系統進行圖像分析并計算皮瓣成活率。皮瓣成活率(%)=皮瓣成活面積/皮瓣總面積×100%。(2)生化指標：將冰凍保存的皮瓣組織標本(共120組)勻漿，離心后取上清液，按照丙二醛檢測試劑盒、超氧化物歧化酶檢測試劑盒說明書檢測。(3)血液流變學：各亞組大鼠抽得的血液標本(共120組)置于北京中勤世帝LG-R-80A血液黏度儀上，立即檢測全血高切、中切、低切黏度、血漿黏度和紅細胞聚集指數等指標。

2 結果

2.1 皮瓣成活率 SO組：大鼠皮瓣全部成活：皮瓣狀態與周圍皮膚組織相同，顏色紅潤，彈性良好，未見水腫。IR組：較多數量皮瓣出現壞死：顏色呈黑色或灰黑色，質地變硬失去彈性，有痂殼形成；個別局部有潰爛或滲出，部分皮瓣下方有血腫形成。PNS組：皮瓣存活情況與SO組相似，少量皮瓣雖出現壞死，但壞死面積明顯小于IR組；部分皮瓣僅表現為在遠端顏色較為發暗，彈性稍差，毛發再生不良，或可見散在結痂創面，其下有少量滲出液，無明顯水腫、血腫。

皮瓣成活率：如表1所示，與SO組相比，IR組大鼠皮瓣成活率明顯較低，統計學上存在顯著性差異(P<0.01)；PNS組皮瓣成活率較SO組為低(P<0.01)，而與IR組相比，PNS組大鼠皮瓣成活率明顯較高，存在顯著性差異(P<0.01)。

表1 術后7 d三組大鼠皮瓣成活率比較

注：與SO組相比，*P<0.01；與IR組相比，**P<0.01

2.2 生化指標 (1)MDA:SO組在5個時點皮瓣組織中的MDA值均保持在較低水平，而IR組和PNS組只在T1和T2時點(即再灌注前)的MDA值保持較低水平，與SO組比較差異無統計學意義(P>0.05)；IR組和PNS組在皮瓣組織再灌注以后(即血管吻合成功后)的T3～5時點MDA值逐漸升高，與SO組在同一時點比較差異有統計學(P<0.05)；PNS組MDA值升高的幅度不如IR組明顯，與IR組在同一時點比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。(2)SOD：SO組在5個時點皮瓣組織中的SOD活力均保持在較高水平，而IR組和PNS組只在T1和T2時點的SOD活力保持較高水平，與SO組比較差異無統計學意義(P>0.05)；IR組和PNS組在再灌注以后的T3～5時點，SOD活力逐漸降低，與SO組在同一時點比較差異有統計學意義(P<0.05)；PNS組SOD活力降低的幅度不如IR組明顯，與IR組在同一時點比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表2 三組大鼠皮瓣不同時間點MDA含量的比較

注：與SO組相比，*P<0.05；與IR組相比，**P<0.05

表3 三組大鼠皮瓣不同時間點SOD活力的比較

注：與SO組相比，*P<0.05；與IR組相比，**P<0.05

2.3 血液流變學 SO組大鼠在5個時點血液流變學各項指標基本沒有變化，而IR組和PNS組只在T1和T2時點各項指標值與SO組比較差異無統計學意義(P>0.05)，而在再灌注以后的T3～5時點各指標值明顯升高，與SO組在同一時點比較差異有統計學意義(P<0.05)；PNS組各指標值升高的幅度不如IR組明顯，與IR組在同一時點比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

3 討論

小血管吻合游離皮瓣移植手術的開展，使病灶部位大面積缺損后施行立即修復成為可能。但吻合血管的游離皮瓣是缺血性組織，在從血管離斷到吻合完成之后血管再通，會人為地造成微血管循環障礙和缺血再灌注損傷。其中包括皮瓣的缺血與血管痙攣、白細胞介導的感染、血小板聚集及內皮細胞損傷引起的血栓形成和氧自由基的釋放導致的氧化應激損傷等[5]。而血液供應量減少及靜脈回流障礙是導致皮瓣缺血壞死和缺血再灌注損傷主要原因，血液循環的重建是皮瓣成活的基礎[6]，因此，改善皮瓣微循環、增加皮瓣的血運、防止皮瓣的再灌注損傷是提高皮瓣成活率的努力方向。本研究建立了大鼠腹部游離皮瓣模型，在實驗設計上選取了特定5個時間點進行分組，其中T1(切斷股動靜脈前)可以認為相當于臨床手術過程中游離皮瓣斷蒂前、T2(血管吻合成功即刻)則可以認為相當于臨床手術過程中皮瓣血管吻合后組織再灌注即將開始，T3～5可認為是游離皮瓣發生缺血再灌注損傷的階段，在這5個時間點進行標本取材，可以動態觀察皮瓣的病理生理變化，以期更好地將實驗結果與臨床實際結合起來分析。

表4 三組大鼠不同時間點血液流變學指標的比較

注：與SO組相比，*P<0.05；與IR組相比，**P<0.05

既往研究已證實三七總皂苷能改善血液流變學,抑制血小板及紅細胞聚集,降低血液黏稠度,擴張微細血管,改善微循環,對抗氧化應激反應，以防止生物膜損傷及鈣超載引起細胞損傷[7-9]。三七總皂苷對氧自由基有清除作用，在組織缺血再灌注損傷后，能顯著減少缺血區組織的脂質過氧化物MDA，提高SOD活性，并能預防性對抗過氧化氫和超氧陰離子引起的氧化性損傷，減輕氧化應激反應對缺血、缺氧組織的損害，因此，對缺血的皮瓣組織具有保護作用[10]。

組織缺血過程中氧自由基產生過多或抗氧化系統活性下降,可引發脂質過氧化反應損傷細胞膜，使細胞受損[11]。氧自由基與生物膜的磷脂、酶和膜受體相關的多不飽和脂肪酸的側鏈及核酸等大分子物質起脂質過氧化反應，形成脂質過氧化產物MDA，能反映機體脂質過氧化水平，其含量可間接反映機體細胞受自由基攻擊的程度[12]。SOD對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關重要的作用，它可對抗與阻斷因氧自由基對細胞造成的損害，并及時修復受損細胞，復原因自由基造成的對細胞傷害。此酶能清除超氧陰離子自由基(O·)，保護細胞免受損傷，SOD活力的高低可間接反映機體清除自由基的能力[13]。本研究結果顯示，皮瓣缺血再灌注后IR組MDA含量隨時間延長逐漸增高，SOD的活性逐漸降低，說明氧自由基在皮瓣內蓄積，并導致膜脂質的過氧化和SOD的消耗。而在腹腔注射三七總皂苷后，PNS組MDA含量較IR組降低而SOD的活性明顯提高，說明三七總皂苷具有清除氧自由基，減輕氧化應激損傷的作用。與生化檢測結果類似，缺血再灌注后，IR組血液流變學各項指標值隨時間延長逐漸增高，說明皮瓣組織血管內血液黏度增加、血細胞聚集，從而導致微循環、微血管血流減緩或停滯，有加重微循環障礙的趨勢；而在腹腔注射了三七總皂苷的PNS組，其各項指標值隨時間延長雖然也逐漸增高，但升高的幅度明顯低于IR組，說明三七總皂苷具有調整血液流變學異常、降低血流阻力、減少血栓形成風險的作用。從最終三組大鼠皮瓣成活率的結果上來看，三七總皂苷干預組的皮瓣成活率明顯比缺血再灌注組要高，因此，可以推測三七總皂苷可能通過改善微循環，減輕氧化損傷導致的再灌注損傷，促進皮瓣移植后的成活。但由于皮瓣缺血、缺氧性損傷的機制比較復雜，目前的實驗結果尚不能排除其他可能的保護機制，需要進一步深入研究三七總皂苷對組織中抗氧化能力和血液流變性是如何發揮調節作用的。綜上所述，三七總皂苷對大鼠移植后的游離皮瓣具有保護作用，為其臨床應用于提高皮瓣存活率提供了一定的理論依據。

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Effects of panax notoginseng saponins on survival of free abdominal skin flap in rats

WANG Zhi1a,ZHI Ke-qian1b*,XU Zhi-peng2,ZHANG Rui-zhi3

(1a.Department of Anesthesiology,1b.Department of Oncological Head and Neck Surgery,Stomatology Hospital of Xi′an Jiaotong University,College of Medicine,Xi′an 710004,China;2 Department of Stomatology ，The People′s Hospital of Shanxi Province,Xi′an 710068,China;3.Department of Stomatology,Ankang Central Hospital,Ankang 725000,China)

Objective To investigate the effects of panax notoginseng saponins (PNS) on hemorrheology and oxidative stress in rats，and to explore the protective effects and mechanism of PNS on survival of free abdominal skin flap.Methods 144 male SD rats were classified into sham operation group (SO group),ischemia/reperfusion group (IR group) and PNS intervening group (PNS group) at random.To establish the models of free skin flap in rat right abdomen.30 min before surgery,rats were intraperitoneal injected PNS for PNS group and saline for SO and IR group.The level of malonyldialdehyde (MDA) and the superoxide dismutase (SOD) activity were compared between these groups,and the survival rate of flap was observed using image analysis.Results The expression of MDA in IR and PNS group was higher than that in the SO group at 4,8,24 hours after reperfusion,especially in the IR group (P<0.05).The activity of SOD and hemorrheology in IR and PNS group was lower than that in the SO group at 4,8,24 hours after reperfusion,especially in the IR group (P<0.05).The survival rate of flap was:IR group

Free skin flap；Oxidative stress；Hemorrheology；Panax notoginseng saponins

2013-12-26

1.西安交通大學口腔醫院a.麻醉科，b.頭頸腫瘤外科，西安710004；2陜西省人民醫院口腔科，西安710068；3安康市中心醫院口腔科，安康 725000

國家自然科學基金資助項目(81272957)；西安市科技計劃項目(SF1023)

*通信作者