去甲斑蝥素抑制人腦膠質瘤細胞增殖的體內外研究

張玉潔，吳 倩，廉 果

去甲斑蝥素抑制人腦膠質瘤細胞增殖的體內外研究

張玉潔，吳 倩*，廉 果

目的 研究去甲斑蝥素(Norcantharidin，NCTD)體內外對人腦膠質瘤細胞的抑制作用。方法 常規培養細胞，24 h后隨機分為陽性對照組、空白對照組和去甲斑蝥素6個劑量組，MTT法檢測NCTD對人腦膠質瘤細胞增殖的抑制作用；流式細胞術檢測細胞凋亡率；建立SHG-44細胞裸鼠異種移植瘤模型，將荷瘤裸鼠隨機分為陰性對照組、順鉑陽性對照組以及NCTD 3個劑量組，腹腔注射給藥12 d后，取血檢測血常規及肝腎功能；處死裸鼠，剝瘤稱重并計算抑瘤率。結果 NCTD 6個劑量組顯著抑制SHG-44細胞的增殖，且呈時間和劑量依耐性；并提高SHG-44細胞的凋亡率；NCTD 3個劑量組可抑制SHG-44細胞裸鼠異種移植瘤的生長，對移植瘤裸鼠血常規及肝腎功能無明顯影響。結論 NCTD體內外均可抑制SHG-44細胞生長，并誘導腫瘤細胞凋亡。

去甲斑蝥素；SHG-44細胞；增殖；凋亡；裸鼠

0 引言

腦膠質瘤可導致患者出現致殘和腦功能缺失表現，死亡率很高。而目前臨床上對腦膠質瘤有效的化療藥物又很少，主要以放射治療和手術治療為主[1]。斑蝥素是一種廣泛應用于臨床的抗腫瘤中藥，但因其具有強烈的泌尿系統刺激作用而限制了其使用。將斑蝥素去除1、2位2個甲基得去甲斑蝥素(Norcantharidin，NCTD)，其藥理活性與斑蝥素相當，但毒副作用降低[2]。NCTD是新型的抗腫瘤中藥，具有較強的抗腫瘤活性和獨特的升白細胞功能[3]，是國際上第一個有升高白細胞作用的抗癌藥物，主要用于治療肝癌、食管癌和胃癌，而其對人腦膠質瘤SHG-44細胞的影響尚不清楚。本實驗檢測了NCTD體內外對SHG-44細胞的影響，為NCTD治療人腦膠質瘤的臨床用藥提供了理論依據。

1 材料、試劑和儀器

人腦膠質瘤SHG-44細胞由華中科技大學同濟醫學院提供；SPF級BALB/C-nu裸鼠，體重16～20 g，購于中國醫學科學院上海實驗動物繁殖中心，按SPF級要求管理；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料公司)；RPMI 1640培養粉(Gibco公司)；順鉑(江蘇豪森藥業股份有限公司)；MTT和胰蛋白酶(Sigma公司)；ELx800型酶聯免疫檢測儀(BIO-TEK公司)；CO2孵箱(JOUAN公司)；流式細胞儀FACS Calibur(Becton Dickinson公司)；其他試劑均為國產分析純。

2 方法

2.1 MTT法檢測NCTD對人腦膠質瘤細胞生長的抑制作用 常規培養人腦膠質瘤SHG-44細胞，待細胞貼壁生長狀態良好時，以1×105/mL密度接種于96孔培養板中，于5% CO2、37 ℃孵箱中預培養24 h后，分別加入不同濃度的NCTD，使最終每組含NCTD濃度分別為：10、20、40、80、160、320 μg/mL，每個濃度6個復孔，并設陽性對照藥順鉑組和正常細胞組，繼續培養。分別于48、72、96 h 3個時相各取出一塊96孔板進行MTT比色實驗：每次于實驗結束前每孔加入MTT，繼續培養4 h后，按常規采用酶標儀(波長570 nm)測定各孔吸光度值(A)。按公式“(1-藥物孔A值/對照孔A值)×100%”計算細胞抑制率，以劑量和生長抑制率作直線相關分析。

2.2 流式細胞術檢測對細胞凋亡的影響 將SHG-44細胞以1×106/mL密度接種于培養瓶中，24 h后隨機分組，分別加入不同濃度的NCTD或陽性對照藥順鉑，對照組加入等體積的1640培養液，繼續培養48 h，常規消化洗滌細胞后，用70%預冷乙醇固定細胞，置4 ℃環境待測凋亡率。檢測前，先離心棄上清，再用PBS洗滌后置于檸檬酸緩沖液中1 h以上，調整細胞濃度至1×106/mL左右，上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

2.3 體內抑瘤實驗 裸鼠皮下移植瘤模型的建立：將約1×107個SHG-44膠質瘤細胞接種于BALB/C-nu裸鼠右腋皮下，致瘤后，無菌條件下以組織塊移植傳代，4代后生物學特征穩定。以無菌技術取出皮下移植瘤，剪切后，按2 mm3/鼠用套管針接種于裸鼠右腋皮下，待腫瘤生長至約100 mm3時，將荷瘤鼠隨機分為5組：正常組、順鉑(20 mg/kg)陽性對照組、NCTD(25、50、100 mg/kg)3個劑量組，每組10只。正常組每日給生理鹽水灌胃，順鉑和NCTD組采用腹腔注射方式給藥，每次0.2 mL，皆連續給藥12 d。

2.3.1 體重、血常規及肝、腎功能的檢測 末次給藥后24 h，對裸鼠行體重稱量后，每只腹腔注射0.5%肝素0.5 mL，使之肝素化，5～6 min后摘除眼球取血，一部分肝素抗凝全血用以檢測血常規中白細胞(leukocyte，Leu)、血紅蛋白(haemoglobin，Hb)和血小板(platalet，Plt)的濃度；另一部分離心分離出血漿，用以檢測肝功能中丙氨酸氨基轉移酶(Alanine aminotransferase，ALT)、γ-谷氨酰轉移酶(γ-glutamyltransferase，γ-GT)和腎功能中血尿素氮(Blood urea nitrogen，BUN)、肌酐(creatinine，Cr)的濃度。

2.3.2 抑瘤率的檢測 取血后，頸椎脫臼處死裸鼠，立即完整剝離瘤塊，稱量瘤塊重量，計算各組平均瘤塊重量及抑瘤率。抑瘤率(%)=[1-(給藥組平均瘤重/陰性對照組平均瘤重)]×100%。

3 結果

3.1 NCTD對SHG-44細胞生長的抑制作用 置顯微鏡下觀察，NCTD作用后的細胞排列稀疏，隨作用時間延長和藥物濃度的增加細胞密度逐漸減少。MTT實驗結果顯示，各劑量組NCTD對SHG-44細胞的增殖均有一定的抑制作用，隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長，抑制率增加，NCTD對SHG-44細胞的抑制作用具有統計學意義。見圖1。

圖1 NCTD對SHG-44細胞增殖的抑制作用

3.2 NCTD對SHG-44細胞凋亡的影響 各濃度NCTD作用于SHG-44細胞后的細胞凋亡率明顯高于對照組，且隨著劑量的增加，細胞凋亡率明顯增加，并出現凋亡典型性特征峰。見表1。

表1 NCTD對SHG-44細胞凋亡的影響

注：與細胞對照組比較，*P<0.001

3.3 NCTD對荷瘤裸鼠血常規、肝腎功能和體重的影響 腹腔注射給藥12 d后，陽性對照組荷瘤裸鼠的白細胞數為(8.1±1.8)×109/L，明顯低于陰性對照組(11.7±2.3)×109/L(P<0.05)；而NCTD 3個給藥組血常規、肝腎功能以及體重的檢測結果與陰性對照組比較差異均無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 荷瘤裸鼠的血常規、肝腎功能和體重檢測結果

注：與陰性對照組比較，*P<0.05

3.4 NCTD對荷瘤裸鼠異種移植瘤生長的抑制作用 腹腔注射NCTD 12 d后，處死各組裸鼠，取瘤塊稱重的結果顯示，高、中、低3個劑量組瘤塊重量均明顯低于陰性對照組(P<0.05或P<0.001)，抑瘤率分別為50.40%、34.86%和19.71%，呈現劑量依賴性，提示NCTD對SHG-44細胞裸鼠異種移植瘤的生長具有明顯的抑制作用，結果見表3。

表3 給藥12 d后各組瘤塊質量及抑瘤率比較

注：與陰性對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

4 討論

膠質瘤是顱內最為常見的原發性惡性腫瘤，發病率占顱內腫瘤的44%。膠質瘤多浸潤性生長，手術很難將顱內侵襲灶完全切除。目前多采用手術、化學治療或放射治療聯合治療，最大限度殺傷腫瘤細胞是膠質瘤綜合治療中的重要環節[4-9]。多數膠質瘤對放射線不敏感，化療藥物又難以透過血腦屏障，目前尚缺乏滿意的治療手段，因此，如何有效地控制甚至治愈膠質瘤仍是亟待解決的難題。去甲斑蝥素不僅具有顯著的抗癌作用，且毒性作用較小，同時具有上調白細胞、保護肝細胞、調節免疫功能等作用，在抗腫瘤方面有著不容忽視的作用。

抑制腫瘤細胞的增殖和促進腫瘤細胞的凋亡是腫瘤防治的關鍵手段之一。細胞凋亡又稱程序性死亡(Programmed cell death)，是生物體為了除去多余、損傷或感染的細胞而進行的主動自殺行為[10]。凋亡不僅直接影響著機體組織的正常發育、分化與死亡，其在腫瘤治療中的作用也已受到極大的重視[11-12]。

本研究發現，NCTD能夠有效地殺傷SHG-44細胞，抑制其增殖，細胞抑制率呈濃度、時間依賴性，且顯微鏡下觀察細胞形態發生明顯的改變。流式細胞儀檢測發現，NCTD還可誘導SHG-44細胞凋亡，且隨著濃度的增大，細胞凋亡率增加，與對照組比較差異有統計學意義，表明NCTD可通過誘導SHG-44細胞凋亡而抑制其增殖。裸鼠異種移植瘤模型是人們進行腫瘤實驗性治療廣泛采用的研究手段，人體內腫瘤與人腫瘤細胞裸鼠異種移植瘤對藥物反應的一致性已獲得證實[13]。

本實驗結果顯示，對建立的SHG-44細胞裸鼠異種移植瘤行腹腔注射方式給藥12 d后，高、中、低3個劑量組的NCTD抑瘤率分別達到50.40%、34.86%和19.71%，提示NCTD具有明顯的體內抗人腦膠質瘤活性，且作用呈現劑量依賴性。

藥物濃度超過一定范圍會帶來毒副作用，通常表現在對胃腸道、造血系統及肝腎功能的影響上。本研究在給藥12 d內觀察移植瘤裸鼠一般狀況，高、中、低3個劑量NCTD給藥組均未見裸鼠有消瘦、厭食、活躍程度下降等明顯異常；給藥12 d后的血常規和肝腎功能檢測結果顯示，3個濃度NCTD給藥組和陰性對照組比較差異均無統計學意義，提示在本研究的給藥劑量下，NCTD對SHG-44細胞具有選擇性殺傷作用，而對裸鼠正常血細胞和肝、腎器官無明顯毒副作用。相比之下，陽性對照組荷瘤裸鼠的白細胞數明顯低于陰性對照組，推測與順鉑具有一定的骨髓抑制性有關。

腫瘤的形成和發展是極其復雜的過程，涉及多個細胞因子及凋亡通路，在治療后期僅依靠去甲斑蝥素抑制惡性膠質瘤難以取得有效的成果，若將其與其他化療藥聯合應用，能否有效控制腫瘤生長，減少耐藥性，值得進一步研究。

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Inhibition effect on human gliomas cell of norcantharidininvivoandinvitro

ZHANG Yu-jie,WU Qian*,LIAN Guo

(Xiangyang Central Hospital,Xiangyang 441021,China)

Objective To study the inhibition effect on human gliomas of norcantharidin (NCTD)invivoandinvitro.Methods Cells were cultivatedinvitro,and then were divided into positive control group,negative control group and NCTD six doses groups randomly after being cultured for 24 h.The cytostatic effect of NCTD on human gliomas was evaluated by MTT assay.Flow cytometry was utilized for measuring the apoptosis.The nude mice with SHG-44 cell xenografts were treated with drugs via intraperitoneal injection daily,and were divided into 5 groups:negative control group,positive control group,NCTD three doses groups.After 12-day treatment,blood routine,liver and kidney function were detected.Results NCTD inhibited cell growth in a concentration and time-dependent manner.And the apoptosis rates were elevated.NCTD remarkably inhibited the growth of SHG-44 cell xenografts,no significant effect was found on nude mice blood,liver and kidney function.Conclusion NCTD can inhibit the growth of SHG-44invitroandinvivo,and induce SHG-44 apoptosis.

NCTD;SHG-44;Proliferation;Apoptosis;Nude mice

2013-06-26

湖北襄陽市中心醫院，湖北 襄陽 441021

*通信作者