螺內酯誘導人急性白血病細胞Jurkat凋亡的作用研究

韓蓮花，蔡 磊，朱 瑩，朱華亭，夏永潔，邱玉華

螺內酯誘導人急性白血病細胞Jurkat凋亡的作用研究

韓蓮花，蔡 磊，朱 瑩，朱華亭，夏永潔，邱玉華*

目的 研究螺內酯對人急性白血病細胞Jurkat體外增殖的抑制及誘導凋亡的作用。方法 將終濃度分別是10、50及100 μmol/L的螺內酯加入Jurkat細胞的培養(yǎng)體系中，24 h內每隔4 h通過 MTT法分析Jurkat細胞的增殖抑制率，Annexin V/PI流式細胞術法分析Jurkat細胞的早期凋亡率。結果 螺內酯與Jurkat細胞共同培養(yǎng)12 h后，螺內酯能顯著增加對細胞的增殖抑制作用，并且與藥物濃度成正相關，各濃度組的抑制率隨著培養(yǎng)時間的延長而升高，與藥物干預時間成正相關；螺內酯處理Jurkat細胞24 h，各濃度組誘導細胞凋亡率分別為：10 μmol/L組(11.2±0.35)%、50 μmol/L組(29.8±1.27)%及100 μmol/L(56.5±1.41)%，各個濃度組誘導細胞凋亡率與藥物濃度成正相關。結論 螺內酯對人T淋巴細胞白血病Jurkat細胞具有抑制增殖和誘導凋亡的作用，提示該藥可能具有潛在抑瘤作用。

螺內酯；Jurkat；增殖抑制；細胞凋亡

0 引言

螺內酯(Spironolactone)是一種臨床上常用的醛固酮拮抗劑,主要用于治療與醛固酮升高有關的頑固性水腫、高血壓及原發(fā)性醛固酮增多癥等疾病。它通過結合胞漿內的鹽皮質激素受體而作為醛固酮的拮抗劑發(fā)揮藥理作用[1]。主要作用于腎臟遠曲小管和集合管，通過阻斷Na+-K+和Na+-H+的交換，使Na+、Cl-和水排泄增多，K+、Mg2+和H+排泄減少，有較強的利尿作用，故該藥在心力衰竭患者的治療中也起著重要的作用[2]。

近年來隨著研究的不斷深入，研究者發(fā)現了螺內酯新的作用。Mikkelsen等[3]報道螺內酯能誘導人體外周血單個核細胞凋亡，并且影響其細胞因子的分泌。這為腫瘤的治療提供了新的思路。本研究以人T淋巴細胞白血病細胞株Jurkat為對象，分析螺內酯對腫瘤細胞生長與增殖的影響，以期為臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 Jurkat細胞由本實驗室保存；螺內酯購自Sigma公司；Annexin V-FITC/PI試劑盒(invitrogen公司)；RPMI 1640(GIBCO公司)；胎牛血清(GIBCO公司)；MTT、DMSO(Sigma公司)；550型酶聯免疫檢測儀(Bio-Rad公司)；流式細胞儀(Beckman公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞株的培養(yǎng) 取本實驗室保存的Jurkat細胞株，常規(guī)復蘇后，RPMI 1640培養(yǎng)液添加10%胎牛血清，于37 ℃、5% CO2、飽和適度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2～3 d傳代1次。觀察細胞生長情況，取對數生長期細胞用于實驗。

1.2.2 螺內酯對Jurkat細胞增殖抑制作用的分析 取生長狀態(tài)良好的Jurkat細胞，調整細胞濃度至2×106/mL，接種于96孔板，200 μL/孔，設置3個復孔。各實驗組加入螺內酯溶液，使其終濃度分別為10、50及100 μmol/L。另設不加藥的對照組，分別于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)時間為4、8、12、16、20及24 h。培養(yǎng)終止前4 h，加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，繼續(xù)孵育4 h，離心后吸棄孔板內培養(yǎng)上清液。加入DMSO 150 μL，微量振蕩器上振蕩搖勻，使結晶充分溶解。酶標儀檢測吸光度值(A570)，并計算增殖抑制率[4]。

細胞增殖抑制率=(A對照組-A實驗組)/A對照組×100%

1.2.3 螺內酯對Jurkat細胞誘導凋亡作用的分析 用含10%胎牛血清RPMI 1640調整細胞濃度至2×105/mL，接種于6孔板，2 mL/孔。加入螺內酯溶液，使終濃度分別為10、50及100 μmol/L，并設不加藥的對照組，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。收集細胞，用冷PBS洗滌2次后，將細胞重懸于100 μL緩沖液，轉移至流式管中。加入Annexin V-FITC 5 μL和PI 1μL，室溫避光孵育15 min，孵育過后，加入400 μL緩沖液，流式細胞儀檢測細胞早期凋亡率[5]。

2 結果

2.1 螺內酯對Jurkat細胞增殖抑制作用 螺內酯與Jurkat細胞共同培養(yǎng)4 h和8 h時，各濃度組對細胞的增殖抑制作用并不顯著，各濃度組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。共同培養(yǎng)12、16、20及24 h時，各濃度組對細胞增殖均呈現明顯的抑制作用，且同一個時間點各濃度組間抑制率差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見表1)。螺內酯與Jurkat細胞共同培養(yǎng)12 h后，對細胞的增殖抑制作用呈現明顯的對藥物濃度和干預時間的依賴性(見圖1)。

表1 螺內酯對Jurkat細胞增殖抑制率的影響

注：與對照組比較，*P<0.05

圖1 不同濃度螺內酯在各干預時間點對Jurkat細胞的增殖抑制作用

2.2 螺內酯對Jurkat細胞誘導凋亡作用 螺內酯處理細胞24 h,對照組與10、50及100 μmol/L各濃度組誘導Jurkat細胞早期凋亡率分別為(2.9±0.23)%、(11.2±0.35)%、(29.8±1.27)%及(56.5±1.41)%，凋亡率呈現明顯的藥物濃度依賴性(見圖2)。

3 討論

螺內酯與鹽皮質激素受體結合而作為醛固酮的拮抗劑發(fā)揮藥理作用，對抗高血壓、醛固酮增多癥等，在臨床上已經使用了近40年，對其藥理作用機制已較清晰[6]。近年來臨床與基礎方面的研究又發(fā)現了一些關于螺內酯與鹽皮質激素受體結合之外的其他作用。臨床研究報道，螺內酯還具有提高充血性心衰患者的生存期，改善內皮功能等作用[7-8]。基礎研究方面，有研究發(fā)現，螺內酯誘導人體外周血單個核細胞凋亡，并且影響其細胞因子的生成。人體外周血單個核細胞與100 μmol/L的螺內酯共培養(yǎng)后，抑制了細胞因子TNF-α的生成，卻增加了IL-1β的生成，并初步猜測凋亡的發(fā)生可能與IL-1β的增多有關。Soren等發(fā)現，螺內酯誘導人體外周血單個核細胞凋亡的機制可能是通過抑制NF-кB這個轉錄因子而起作用，并且這種作用不依賴于鹽皮質激素受體[9-10]。他們在實驗中發(fā)現，螺內酯影響很多與炎癥因子和凋亡過程的相關基因，當人體外周血單個核細胞和不同濃度螺內酯共同培養(yǎng)后，caspase-3的活性增強，而NF-кB的活性降低，初步認為螺內酯可能是通過抑制NF-кB的活性而誘導人體外周血單個核細胞凋亡[10]。

A：對照組，B：10 μmol/L組，C：50 μmol/L組，D：100 μmol/L組

為了探討螺內酯對某些腫瘤細胞是否也有誘導凋亡的作用，本研究選擇了Jurkat細胞作為研究對象，通過兩種方法來分析不同濃度螺內酯和Jurkat細胞共同培養(yǎng)后對該細胞的作用。首先通過MTT法分析不同濃度螺內酯在各個時間點對Jurkat細胞的增殖抑制作用。在4 h和8 h的培養(yǎng)時間點，螺內酯對Jurkat細胞的增殖抑制作用并不顯著，從12 h開始，不同濃度的螺內酯對Jurkat細胞產生了顯著的增殖抑制作用，并且其作用呈現藥物濃度和干預時間的依賴性。其次，通過Annexin V/PI流式細胞術法分析螺內酯誘導Jurkat細胞凋亡的作用。根據MTT的結果，我們選擇了24 h作為研究早期凋亡的時間點，分析不同濃度螺內酯誘導Jurkat細胞凋亡的作用。發(fā)現最小濃度10 μmol/L螺內酯對Jurkat細胞就已經有誘導凋亡的作用，并且藥物干預濃度越高，其誘導凋亡的作用越強，存在明顯的濃度依賴性。在研究中由于螺內酯的溶解度問題，我們沒能選擇更高濃度來分析。

本研究通過觀察螺內酯誘導Jurkat細胞的調亡情況，說明螺內酯可能對某些血液腫瘤細胞也有誘導凋亡的作用，接下來我們還會選擇其他的腫瘤細胞作為研究對象，更深入地研究螺內酯誘導凋亡的作用。而本實驗中誘導Jurkat細胞凋亡的具體機制，我們也將從NF-кB途徑開始作下一步研究。

總之，螺內酯對人T淋巴細胞白血病Jurkat細胞有誘導凋亡作用，體外誘導凋亡的劑量亦較低，提示該藥可能存在潛在的抑瘤作用，對于我們尋求改善淋巴細胞白血病的方法也具有潛在的價值。

[1] Jankowski A,Skorek-Jankowska A,Lamparczyk H.Simultaneous determination of spironolatone and its metabolites in human plasma[J].J Pharm Biomed Anal,1996,14(8-10):1359-1365.

[2] 程遠植.醛固酮拮抗劑螺內酯在慢性心力衰竭治療中的作用機制和應用進展[J].中華心血管病雜志,2003,31(1):69-71.

[3] Mikkelsen M,Sφnder SU,Nersting J,et al.Spironolactone induces apoptosis in human mononuclear cells.Association between apoptosis and cytokine suppression[J].Apoptosis,2006,11(4):573-579.

[4] 王艷茹,馬泓冰,陳永井，等.CD80人-鼠嵌合抗體對B淋巴瘤細胞株Raji與Daudi的生長抑制及殺傷作用[J].細胞與分子免疫學雜志,2009,25(7):615-618.

[5] 劉玉華,孫杰,陳明心，等.B7-2基因工程抗體的制備及體內外抗B淋巴瘤作用研究[J].中山大學學報(自然科學版),2010,49(3):108-112.

[6] Garthwaite SM,McMahon EG.The evolution of aldosterone antagonists[J].Mol Cell Endocrinol,2004,217(1-2):27-31.

[7] Pitt B,Zannad F,Remme WJ,et al.The effect of spironolactone on morbidity and mortality in patients with severe heart failure.Randomized Aldactone Evaluation Study Investigators[J].N Engl J Med,1999,341(10):709-17.

[8] 惠麗超，邱剛.螺內酯治療慢性心力衰竭的臨床觀察[J].中國實用醫(yī)藥,2010,5(2):156-157.

[9] S?nder SU,Woetmann A,Odum N,et al.Spironolactone induces apoptosis and inhibits NF-kappaB independent of the mineralocorticoid receptor[J].Apoptosis,2006,11(12):2159-2165.

[10]S?nder SU,Mikkelsen M,Rieneck K,et al.Effects of spironolactone on human blood mononuclear cells:mineralocorticoid receptor independent effects on gene expression and late apoptosis induction[J].Br J Pharmacol,2006,148(1):46-53.

Study on apoptosis of human T-acute lymphoblastic leukemia cells lines Jurkat treated with spironolactone

HAN Lian-hua,CAI Lei,ZHU Ying,ZHU Hua-ting,XIA Yong-jie,QIU Yu-hua

(Department of Immunology,Medical College,Soochow University,Suzhou 215123,China)

Objective To study the proliferated inhibition and apoptosis of human T-acute lymphoblastic leukemia cells lines Jurkat treated with spironolactone.Methods Jurkat cells were treated with different concentrations of spironolactone (10,50,100 μmol/L) in culture.MTT assay was used to observe the proliferated inhibition rate of Jurkat at 4 hours interval and the flow cytometry was applied to analyze Annexin V/PI apoptosis rate of Jurkat.Results 12 hours after treatment,spironolactone could obviously inhibit the proliferation of Jurkat and the effect had dose and treated time dependence.24 hours after treatment,apoptosis of these concentrations were(11.2±0.35)%,(29.8±1.27)%,(56.5±1.41)%,and the apoptosis rate increased in dose dependence.Conclusion Spironolactone can inhibit the proliferation and induce apoptosis of Jurkat,it suggests that this medicine may have the effect of tumor inhibition.

Spironolactone;Jurkat;Proliferated inhibition;Cell apoptosis

2013-10-25

蘇州大學醫(yī)學部免疫學系，蘇州 215123

江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計劃(CXLX12_0821)

*通信作者