靈芝孢子粉對帕金森病大鼠氧化應激反應和神經炎癥反應的影響

鮑 琛

靈芝孢子粉對帕金森病大鼠氧化應激反應和神經炎癥反應的影響

鮑 琛

目的 研究靈芝孢子粉對帕金森病(PD)模型大鼠的氧化應激反應和神經炎癥反應的影響，探討靈芝孢子粉治療帕金森病的潛在作用機制。方法 采用腦內定位注射6-羥基多巴胺(6-OHDA)建立PD大鼠模型，在模型建立成功后給予靈芝孢子粉治療(25 g/kg)。給藥30 d后，測定大鼠腦組織中丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、一氧化氮(NO)和α-腫瘤壞死因子(TNF-α)的含量，以及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活力。結果 靈芝孢子粉治療組可明顯降低PD模型大鼠腦組織中MDA、NO和TNF-α含量，增加GSH 含量，提高SOD、GSH-PX的活性。結論 靈芝孢子粉對PD模型大鼠具有保護作用，其機制可能與靈芝孢子粉減輕6-OHDA 所致的氧化應激損傷和神經炎癥反應有關。

靈芝孢子粉；帕金森病；大鼠；氧化應激；神經炎癥

0 引言

靈芝孢子(Ganodermalucidiumspore)是靈芝生長成熟期從菌蓋彈射出來極其細小的孢子，為靈芝的生殖細胞，具有靈芝的全部遺傳活性物質，其藥用價值日益受到重視。現代藥理研究表明，靈芝孢子粉具有許多藥理作用，包括抗腫瘤、增加免疫調節、抗病毒、抗炎、清除自由基等[1-2]。帕金森病(Parkinson′s disease，PD)是一種以黑質紋狀體通路的退變為主要特征的神經系統變性疾病。迄今為止，PD的治療仍為對癥治療，無法阻止疾病進展[3-5]。以往的研究發現，靈芝孢子粉對PD模型大鼠具有一定的腦保護作用[6-9]。本實驗我們觀察了靈芝孢子粉對PD大鼠的氧化應激反應和神經炎癥反應的影響，旨在揭示靈芝孢子粉治療PD的潛在作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試藥 靈芝孢子粉(元芝堂靈芝科技有限公司)；鹽酸氯胺酮注射液(北京雙鶴藥業股份有限公司，0.1 g：2 mL)；6-羥基多巴胺(6-OHDA)購自美國Sigma公司；丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供；一氧化氮(NO)及α-腫瘤壞死因子(TNF-α)試劑盒由北京中杉生物技術有限公司提供。

1.1.2 動物 健康Wistar雄性大鼠40只，體重195～210 g，由浙江省醫學科學院動物中心提供,動物合格證號:SCXK(浙)2003-0001。實驗室環境：溫度，25 ℃，相對濕度，40%～70%；動物照度：15～20 LUX；墊料為消毒墊料，籠具用過氧乙酸消毒后使用，飲用純凈水。

1.2 方法

1.2.1 帕金森病大鼠模型的制備 30只大鼠用鹽酸氯胺酮(80 mg/kg)腹腔注射麻醉。然后將大鼠固定于腦立體定位儀上，頭部去毛，用活力碘常規消毒。無菌條件，沿正中線切開大鼠顱頂皮膚，剝離骨膜，暴露前囟。以前囟為準，根據大鼠腦立體定位圖譜確定右側黑質紋狀體區坐標：(1)前囟后5.2 mm，正中線右側1.0 mm，硬膜下9.0 mm。(2)前囟后5.2 mm，正中線右側2.5 mm，硬膜下8.5 mm[10]。用顱骨鉆小心鉆開顱骨，微量進樣器緩慢注入4 μL的6-OHDA(溶于含0.02%的抗壞血酸生理鹽水，濃度為2 μg/μL)，注射速度為0.8 μL/min，術畢留針5 min，退針速度1 mm/min，手術完成后取醫用海綿填塞顱骨孔，縫合切口皮膚，活力碘消毒。術后2周用鹽酸去水嗎啡(0.5 mg/kg)誘導大鼠對側旋轉行為，計數30 min內大鼠向左側旋轉的圈數，總旋轉圈數大于210圈為造模成功。

1.2.2 實驗動物分組及處理 挑選造模成功的20只PD大鼠隨機分為2組，記為模型組(6-OHDA，10只)和靈芝孢子粉治療組(25 g/kg，10只)，另納入10只正常大鼠為正常對照組。以灌胃的方式給予治療組大鼠靈芝孢子粉，每天1次，給藥體積2 mL，連續30 d，同時正常組和模型組灌胃給予等量生理鹽水。各組大鼠在給藥30 d后，腹腔注射鹽酸去水嗎啡(0.5 mg/kg)，誘發大鼠向左側旋轉，記錄30 min內的旋轉次數。

1.2.3 大鼠腦組織勻漿的制備 在給藥30 d行為學檢測結束后，所有動物麻醉并快速斷頭處死，在冰皿上迅速分離雙側腦組織，取腦組織塊約0.3～0.4 g，在4 ℃的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，電子天平稱重，再加入4 ℃生理鹽水后勻漿。將勻漿液以4 000 r/min離心15 min。將上清液置-80 ℃冰箱中備用。

1.2.4 腦組織氧化應激水平測定 取適量上清液進行MDA、GSH、GSH-Px和SOD的檢測，具體方法按南京建成生物工程研究所試劑盒說明書步驟進行測試。

1.2.5 腦組織炎癥因子水平測定 取適量上清液進行NO及TNF-α的檢測，具體方法按北京中杉生物技術有限公司試劑盒說明書步驟進行測試。

2 結果

2.1 對大鼠旋轉行為的影響 正常對照組在治療前后均未出現旋轉行為。模型對照組在治療前后30 min的旋轉圈數分別為(297.33±28.45)次和(300.78±34.28)次，差異無統計學意義。靈芝孢子粉治療組在治療前后30 min的旋轉圈數分別為(298.26±31.67)次和(233.16±17.45)次，經過治療后旋轉圈數明顯減少(P<0.05)。

2.2 靈芝孢子粉對PD大鼠腦組織氧化應激水平的影響 與正常對照組相比，模型組大鼠大腦皮質MDA含量顯著增加(P<0.01)，GSH、GSH-Px、SOD的含量顯著減少(P<0.01)。與模型組相比，靈芝孢子粉給藥組MDA的含量顯著減少(P<0.01)，GSH，GSH-Px和SOD水平均顯著增加(P<0.05或0.01)。見表1。

表1 靈芝孢子粉對PD大鼠腦組織MDA、GSH、GSH-Px和SOD的影響

注：與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

2.3 靈芝孢子粉對PD大鼠腦組織炎癥因子水平的影響 與正常對照組相比，模型組大鼠大腦皮質NO和TNF-α含量顯著增加(P<0.01)。與模型組相比，靈芝孢子粉給藥組NO和TNF-α含量顯著減少(P<0.01)。見表2。

3 討論

6-OHDA是兒茶酚胺的羥基化衍生物，其結構與兒茶酚胺類似，內源性6-OHDA可能由過量Fe3+誘發產生，外源性給予6-OHDA被多巴胺(DA)能神經元攝入后，可產生大量自由基，抑制線粒體呼吸鏈的功能，最終導致DA能神經元死亡[11]。作為一種有效導致DA能神經元變性的神經毒劑，6-OHDA PD模型是目前常用的方法，已廣泛應用于PD發病機制和治療方法的研究[12]。

以往的研究發現，靈芝孢子粉對脂多糖(LPS)所致的多巴胺能神經元變性起到一定的神經保護作用[6]，能夠提高PD模型大鼠腦黑質酪氨酸羥化酶(TH)的表達[7]，逆轉PD模型大鼠黑質、紋狀體神經遞質DA、3，4-雙羥苯乙酸(DOPAC)、高香草酸(HAV)、5-羥色胺(5-TH)、去甲腎上腺素(NE)含量的下降[8]，降低caspase-3的表達[9]，對PD大鼠有腦保護作用。本實驗我們采用6-OHDA制備PD大鼠模型，觀察靈芝孢子粉對PD大鼠的氧化應激反應和神經炎癥反應的影響。

表2 靈芝孢子粉對PD大鼠腦組織NO和TNF-α的影響

注：正常組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01

雖然PD的發病原因尚未完全清楚，但已有多項研究認為免疫炎性機制可能參與了PD神經變性的發病過程[14]。中樞神經系統中的小膠質細胞是腦內免疫反應的抗原遞呈細胞和主要的免疫效應細胞，正常情況下，腦內的小膠質細胞處于靜止狀態。在PD發病過程中，小膠質細胞被異常激活，它的作用除了吞噬清除變性死亡的神經元外，還分泌促炎因子和神經營養因子，如NO和TNF-α。NO是一種具有廣泛生物學效應的小分子化合物，在腦內幾乎所有的神經細胞都具有合成NO的能力，但過量的NO會表現出其神經毒性，引起細胞損傷。TNF-α是目前公認的在免疫反應與細胞凋亡中發揮重要作用的一種細胞因子。研究發現，PD患者及其動物模型中TNF-α的含量升高，另外在對PD中TNF-α抗體和受體以及干預性應用TNF-α對DA能神經元影響的研究發現，TNF-α在PD發病中起到破壞性作用[15]。本實驗研究結果表明，靈芝孢子粉對PD大鼠治療后，大鼠腦組織中NO和TNF-α的含量明顯降低，提示靈芝孢子粉可能通過降低腦內NO及細胞因子TNF-α水平，以保護神經元免受損傷而有效治療PD。

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Effect ofGanodermalucidiumsporeon oxidative stress and inflammatory responses in rats with parkinson′s disease

BAO Chen

(The First Hospital of Ninghai,Zhejiang 315600,China)

Objective To observe the effects ofGanodermalucidiumsporeon oxidative stress and inflammatory responses in rats with Parkinson′s disease (PD).Methods The PD model rats were induced by injecting 6-hydroxydopamine (6-OHDA) into the right striatum.Ganodermalucidiumspore(25 g/kg) was given orally once daily for 30 days.The contents of malondialdehyde (MDA),glutathione (GSH),nitric oxide (NO),tumor necrosis factor-α (TNF-α),and the activity of superoxide dismutase (SOD),glutathione-peroxidase (GSH-PX) in the brain tissues were detected respectively.Results After treatment,Ganodermalucidiumsporecan decrease the levels of MDA,NO and TNF-α obviously,and increase significantly the activity of SOD,GSH-PX and the content of GSH (P<0.05 or 0.01).Conclusion The protective effect ofGanodermalucidiumsporeagainst 6-OHDA-induced brain injury of PD model rats may rely on its ability to reduce oxidative stress and suppress inflammatory responses.

Ganodermalucidiumspore;Parkinson′s disease;Rats;Oxidative stress;Inflammatory responses

2013-06-26

寧海縣第一醫院,浙江 寧海315600