壯實鹿角珊瑚纖維素降解菌的選育

劉海青 劉富平 胡文婷

摘要：采用富集平板稀釋法、剛果紅染色法選育壯實鹿角珊瑚纖維素分解菌，用DNS法測定菌株降解纖維素酶活。結果表明，壯實鹿角珊瑚體內含有共附生纖維素分解菌，該菌可分泌降解纖維素酶，富集培養及剛果紅染色法可有效篩選此類活性菌株。

關鍵詞：壯實鹿角珊瑚；纖維素；生物質

中圖分類號： Q939.9文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）02-0329-02

收稿日期：2013-05-29

基金項目：長江學者和創新團隊發展計劃（編號：IRT1123）；海南省教育廳高等學校科學研究項目（編號：Hjkj2008-15）；海南大學青年基金（編號：qnjj1151）。

作者簡介：劉海青（1971—），女，山西大同人，碩士，副教授，主要從事天然產物活性研究。Tel：（0898）66289567；E-mail：892035892@qq.com。

通信作者：劉富平，博士，副教授，主要從事微生物制藥研究。生物質是唯一可以轉化為液體燃料的可再生能源[1]，以木屑、農作物秸稈、椰殼等生物質為原料的纖維素乙醇，不僅避免了生物乙醇與人爭糧爭地的弊端，而且燃放時釋放的溫室氣體與燃燒汽油相比少90%[2]。微生物是纖維素酶的主要來源[3]，分離、選育出針對不同行業的高效降解纖維素菌種，促使纖維素資源化利用已成為國內外的研究熱點[4]。海洋微生物資源豐富，許多微生物寄生在珊瑚體內或附著在珊瑚表面，與珊瑚協同進化，在演化過程中二者形成了互惠關系[5]。海洋高鹽、高壓、低溫、寡營養等獨特的環境賦予了海洋微生物獨特的代謝途徑[6]。珊瑚共附生菌不僅能夠獨立產生豐富的次生代謝產物，還可分泌具有各種功能的活性酶，參與珊瑚次生成分的合成，或對珊瑚次生代謝產物進行轉化[7]，是天然產物新的來源。本研究選育壯實鹿角珊瑚纖維素分解菌，旨在為促進纖維素資源化利用提供依據。

1材料與方法

1.1材料

壯實鹿角珊瑚樣品采自海南島蜈支洲近海海域。富集培養基（CMC）：KH2PO4 0.2% 、MgSO4 0.015%、KNO3 0.1%、CMC-Na 1%，共100 mL。馬鈴薯培養基：馬鈴薯100 g、葡萄糖10 g、NaCl 5 g、瓊脂7.5～100 g、無菌水500 mL、pH值自然，共500 mL。真菌初篩培養基：K2HPO4 2.0 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、NaCl 6 g、CMC-Na 15 g、瓊脂粉 1.5%、（NH4）2SO4 2.0 g、CaCl2 0.1 g、KH2PO4 0.5 g、pH值70～74、蒸餾水1 000 mL。真菌保種培養基：真菌培養基（PDA）。甲液：將6.9 g結晶苯酚溶于15.2 mL 10% NaOH溶液，用蒸餾水稀釋至69 mL，在此溶液中加入6.9 g亞硫酸氫鈉。乙液：將255 g酒石酸鉀鈉溶于300 mL 10% NaOH溶液中，再加入880 mL 1% 3，5-二硝基水楊酸溶液。將甲乙溶液混合即得黃色試劑，儲于棕色瓶中放置7～10 d后使用。溶液在棕色瓶內保存1年有效。

1.2方法

1.2.1壯實鹿角珊瑚樣品懸液的制備將30 g壯實鹿角珊瑚樣品加少量水磨碎后轉移至盛有10 mL CMC富集培養液中，靜置。

1.2.2纖維素降解菌的富集培養取以上壯實鹿角珊瑚樣品懸液10 mL轉入無菌三角瓶中，30 ℃下振蕩培養1～3 d，按2%的接種量，取0.2 mL菌液轉接至10 mL新富集培養基CMC2中進行第2次富集培養。

1.2.3纖維素降解菌的篩選分別取富集培養后的2種菌懸液各1 mL做系列稀釋，稀釋105～107倍，每種菌液取 0.1 mL 分別涂布于真菌培養基PDA及細菌選擇平板，每種稀釋倍數做3個平行板，平板于30 ℃下恒溫培養1～3 d，以平板上出現均勻的單菌落為準。待長出單菌落后（以40個單菌落為準）選取4個平板。用接種環挑選單菌落點種在真菌及細菌初篩培養基上，每板接種5株菌株。每株菌株點種2個平板，1個平板用于剛果紅染色，另一個作為保存平板。

1.2.4纖維素降解菌的初步鑒定剛果紅染色法：30 ℃培養1～3 d后，測量并記錄各菌落直徑后用70%乙醇將菌落洗下，然后用0.1%剛果紅浸染30 min，傾去染液，再用1 mol/L NaCl浸泡脫色30 min，傾去NaCl浸泡液，觀察菌落周圍有無透明圈，若有透明圈，測量并記錄透明圈的直徑，計算透明圈直徑與菌落直徑的比值（HC值）。

1.2.5纖維素降解菌的分離純化挑選HC值大于1的菌株作為初篩菌種，通過連續劃線法分離純化菌株，將鏡檢后得到的初篩菌株轉接到保種培養基保藏斜面，4 ℃下保藏備用。

2結果與分析

2.1纖維素降解菌的篩選

采用以CMC-Na為唯一碳源富集平板稀釋分離，圖1、圖2為壯實鹿角珊瑚真菌第3天至第8天的生長變化過程，第3天培養基上長出1個圓斑，營養菌絲呈圓形晶亮白色放射狀，中間有1個黑色孢子囊，孢子囊逐漸向周圍擴散，覆蓋了白色菌絲。

2.2纖維素降解菌的初步鑒定

經剛果紅染色法初步鑒定，分離到1株具有降解纖維素能力的真菌，試驗表明，纖維素降解菌染色后能在纖維素瓊脂培養基上快速產生清亮的透明圈，HC值>1（圖3、圖4）。

3結論與討論

本研究表明，壯實鹿角珊瑚體內含有共附生纖維素分解菌，該菌可分泌降解纖維素酶，富集培養及剛果紅染色法可有效篩選此類活性菌株。筆者最初采用羧甲基纖維素鈉CMC-Na-剛果紅培養基進行纖維素降解菌初篩，但是菌株無法在培養基上生長且不能產生透明圈，所以改用富集后的培養液進行梯度稀釋，涂布于PDA培養基上培養，然后轉接到真菌初篩培養基上，再用剛果紅染色法染色，1～2 d后可以看到清晰的透明圈，說明此菌株只能以先培養后剛果紅染色的方法進行初步鑒定。

參考文獻：

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