正交實驗優化多頻超聲波輔助法提取綠茶茶多酚工藝

楊雅瑜，劉玉德，張 媛，石學智

（北京工商大學，材料與機械工程學院，北京 100048）

茶多酚（Tea Polyphenols）是茶葉中多酚類物質的總稱，包括黃烷醇類、花色苷類、黃酮類、黃酮醇類和酚酸類等。其中以黃烷醇類物質（兒茶素）最為重要，含量約占茶多酚總量的70%左右。茶多酚又稱茶鞣或茶單寧，是形成茶葉色香味的主要成份之一，也是茶葉中有保健功能的主要成份之一［1－3］。研究表明，茶多酚等活性物質具有解毒和抗輻射作用，能有效地阻止放射性物質侵入骨髓，并可使鍶90和鈷60迅速排出體外，被健康及醫學界譽為“輻射克星”［4－6］。我國對茶多酚的研究始于上世紀五六十年代，到七十年代初已開始專項研究，目前已處于世界領先水平［7－9］。現今茶多酚的功能引起了各國的廣泛重視，成為各工業化國家的技術競爭目標和研究開發熱點［10－11］。然而，目前應用較多的還是有機溶劑萃取法和金屬離子沉淀法，所得產品具有潛在的毒害。并且，大多數茶多酚提取工藝的提取率較低。因此，需大力開發和推廣無毒、無污染、高效的茶多酚提取新工藝，并對提取工藝做出進一步改進和創新，提高茶多酚提取率。而超聲輔助提取技術作為一種新的提取分離技術對提高茶多酚提取率，降低物耗、能耗等均有顯著的作用和優勢，有著廣闊的應用前景［12－14］。通過目前的研究成果可知，由于超聲波具有的機械粉碎和空化效應等作用，增大了物質分子運動頻率和速度，從而使多頻超聲輔助提取茶多酚工藝可以有效提高提取率。本文將多頻超聲輔助法和傳統浸提法兩種提取方法進行比較研究，用正交實驗優化多頻超聲輔助法提取茶多酚的工藝，得到最佳工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

陳年綠茶 市售;去離子水 北京工商大學自制;硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀等 均為分析純。

循環超聲提取設備 DFXHTQ－900，南京新辰生物科技有限公司;高速萬能粉碎機 FW－100，北京中興偉業儀器有限公司;電子天平 FA2004，上海越平科學儀器有限公司;循環水式真空泵:SHZ－D（Ⅲ） 河南省予華儀器有限公司;紫外可見分光光度計 UVmini－1240，北京東方安諾生化科技有限公司。

1.2 試劑及茶多酚含量測定方法

1.2.1 酒石酸亞鐵溶液 稱取1.0g硫酸亞鐵（FeSO4·7H20）和 5.0g酒石酸鉀鈉（C14H4O6KNa·4H2O），用水溶解并定容至1L（低溫保存有效期10d）。

1.2.2 pH7.5磷酸鹽緩沖 0.67mol/L磷酸二氫鉀:稱取經110℃烘干2h的磷酸二氫鉀（KH2PO4）9.08g，加水溶解后定容至1L。

取上述0.67mol/L的磷酸氫二鈉溶液85mL和0.67mol/L的磷酸二氫鉀溶液15mL混合均勻。

1.2.3 取樣 按GB/T8302的規定［15］。

1.2.4 試樣制備 按 GB/T8303的規定［16］。樣品預處理，將茶葉用萬能粉碎機粉碎后過篩（60目），存放于干燥避光備用。

1.2.5 試液制備 傳統浸取法將樣品茶葉末至于容器中，加入去離子水中，混勻，以提取溫度、提取時間與料液比為設定條件進行傳統浸提;多頻超聲輔助法將樣品放入循環超聲提取設備，以提取溫度、提取時間、料液比、超聲功率與循環速度為設定條件，進行多頻超聲波提取。將浸提液和提取液冷卻至室溫，取上清液置于100mL燒杯中。

隨著全球經濟的一體化，在高科技發展迅猛的今天，我國各個行業已經進入了信息網絡化、自動化的時代，各個行業各個領域都已經離不開信息技術，并在其中發揮了非常重要及關鍵的作用。通過現代化的信息技術可以更好的歸類管理與儲存檔案信息，可以有效的避免了傳統檔案管理所存在的缺陷與不足。所以我們政府檔案管理人員也應該積極的運用現代信息技術，把人才的優勢充分發揮出來，建設一個能夠滿足本地發展的檔案管理體系，這樣不僅使檔案的安全性得到提高，同時還能夠使資料整合性得到有效提高。

1.2.6 茶多酚提取率的測定方法 按照GB/T8313－2002《茶 茶多酚測定》中的方法快速測定提取率［17］。

結果計算方法和公式:

茶多酚提取率，以干態質量百分率表示，按下式計算:

式中:L1－試樣的總量，mL;L2－測定時的用液量，mL;M0－試樣的質量，g;m－試樣干物質含量百分率，%;A－試樣的吸光度;1.957－用10mm比色杯。

當吸光度等于0.50時，每毫升茶湯中含茶多酚當1.957mg。如果符合重復性的要求（即同一樣品的兩次測定值之差，每100g試樣不得超過0.5g），則取兩次測定的算術平均值作為結果。

1.3 實驗方法

1.3.1 料液比對茶多酚提取率的影響 傳統浸提法:配制不同料液比的試液，在60℃水溫下，浸提30min;多頻超聲波提取法:設定四種不同頻率的超聲波同時工作（28kHz，200W）、（33kHz，200W）、（40kHz，200W）、（60kHz，200W），配制不同料液比的試液，設置溫度為60℃，循環速度為700r/min，提取30min。計算兩種方法不同料液比的提取率。

1.3.2 提取時間對茶多酚提取率的影響 傳統浸提法:配制料液比為1∶80g/mL的試液;多頻超聲波提取法:設定四種不同頻率的超聲波同時工作（28kHz，200W）、（33kHz，200W）、（40kHz，200W）、（60kHz，200W），配制料液比為1∶70g/mL的試液，設置循環速度700r/min，水溫60℃。用兩種方法分別提取10、20、30、40、50、60、70、80min，并計算相應的提取率。

1.3.3 溫度對茶多酚提取率的影響 傳統浸提法:配制料液比1∶80g/mL，設定時間為70min;多頻超聲提取法:設置四種超聲波（28kHz，200W、33kHz，200W、40kHz，200W、60kHz，200W）同時工作，配制料液比1∶70g/mL，設定時間為20min。用兩種方法分別在 40、50、60、70、80、90℃水溫下提取，并計算相應提取率。

1.3.5 循環速度對茶多酚提取率的影響 設置四種超聲波（28kHz，200W）、（33kHz，200W）、（40kHz，200W）、（60kHz，200W）同時工作，配制料液比1∶70g/mL，設定時間為20min，溫度為60℃，循環速度分別為 300、700、1000、1200、1500、2000r/min，并計算相應的提取率。

1.3.6 多頻超聲輔助提取茶多酚優化工藝研究［18－20］以單因素實驗得到的影響因素作為參考，再用正交實驗多頻超聲輔助提取茶多酚優化工藝進行研究。選擇提取時間、提取溫度、料液比、超聲波功率、超聲波頻率水平因素，如表1所示，根據混合正交表L16（45）進行正交實驗并分析。

1.3.7 實驗方法分析 實驗方法有單因素實驗和正交實驗。采用單因素實驗方案，分別研究浸提時間、浸提溫度、料液比、循環速度與超聲功率等因素對茶多酚提取分離效果的影響，找出每個因素的具體影響規律，并確定影響茶多酚浸提率的重要因素的最優水平變化范圍。采用正交實驗來確定多頻超聲提取茶多酚的最佳提取工藝條件［21－25］。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

表1 正交實驗因素及水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

2.1.1 料液比對茶多酚提取率的影響 結果如圖1所示:

圖1 料液比對茶多酚提取率的影響Fig.1 The effect of material liquid ratio on the extraction rate of tea polyphenols

料液比取值范圍為1∶20至1∶90g/mL。由圖1可知，隨著液體比例的增大，茶多酚提取率先增加后減少。這是因為茶多酚的溶出量隨著液體比例的增加而增大，但是，液體比例增加到一定程度后，茶多酚溶出量增長變得緩慢，提取率反而下降。傳統浸提料液比為1∶80g/mL時，提取率最大，為15.93%;超聲提取料液比為 1∶70g/mL時，提取率最大，為24.10%。由此可看出，多頻超聲提取與傳統溶劑提取相比，可以減少溶劑的使用量，節約溶劑，并且提取率較高。

2.1.2 提取時間對茶多酚提取率的影響，結果如圖2所示。

圖2 時間對茶多酚提取率的影響Fig.2 The effect of the extraction time on the extraction rate of tea polyphenols

提取時間的取值范圍為10～80min。由圖2可知，隨著超聲提取時間的延長，多頻超聲輔助提取茶多酚的提取率先增大后降低，超聲提取20min時提取率便達到最大24.50%;傳統浸提70min時，提取率最大17.85%。由此可看出，多頻超聲提取明顯縮短了提取時間，這是由于超聲波所具有的機械粉碎和空化效應等作用，增大了物質分子運動頻率和速度，增加了溶劑的穿透力，提高茶多酚溶出速度和溶出數量，從而大大縮短了茶多酚的提取時間［26－27］。

2.1.3 溫度對茶多酚提取率的影響，結果如圖3所示。

圖3 溫度對茶多酚提取率的影響Fig.3 The effect of the extraction temperature on the extraction rate of tea polyphenols

溫度的取值范圍為35～95℃。由圖3可知，在選定范圍內，適當提高溫度對茶多酚提取是有利的，提取溫度的升高可以加快茶多酚的溶解。傳統浸提法在70℃水溫下提取率最大17.88%。超聲提取在60℃時提取率最大24.63%。但過高的溫度會加速茶多酚氧化，提取率反而有所下降。這是因為茶多酚是一種多羥基酚類物質，熱穩定性不好，高溫下加熱時間一長易被氧化，導致一部分茶多酚丟失，另外，隨著溫度的繼續升高，超聲波的空化效應減弱，提取能力降低。

綜合以上各個單因素實驗可得:傳統浸提的適宜條件是:料液比1∶80g/mL，時間70min，溫度80℃，提取率最大為17.88%。

2.1.4 超聲波功率對茶多酚提取率的影響，結果如圖4所示。

圖4 功率對茶多酚提取率的影響Fig.4 The effect of multi－frequency ultrasonic power on the extraction rate of tea polyphenols

超聲波功率取值范圍為100～1000W。由圖4可知，超聲波功率較小時，隨著超聲波功率的增大，茶多酚提取率也隨之增大，200W時提取率最大24.63%，之后繼續增大超聲功率，提取率逐漸下降。這主要是因為超聲功率增大，超聲作用增強，使空化泡的運動比較劇烈;但是隨著超聲功率進一步增大，加速了提取液的流動，從而物料停留在超聲場中的時間減少，破壁作用隨之減弱，茶多酚溶出速率減小，再加上功率越大，產生的熱效應越強可能破壞茶多酚的結構，使得有效的茶多酚含量減少。

2.1.5 循環速度對茶多酚提取率的影響，結果如圖5所示。

循環速度取值范圍為300～2100r/min。由圖5的結果可以看出，隨著循環速度的提高，茶多酚的提取率總體趨勢隨著轉速的增加先升高后降低;1200r/min時，提取率最大為25.49%，其原因主要是由于電機的攪拌有利于茶葉顆粒的擴散，加速了茶多酚的溶出，從而提高茶多酚的提取率;而當轉速過大時，易產生渦流，抑制了空化效應的產生，同時由于渦流卷入大量的空氣，加劇茶多酚被溶劑中的溶解氧氧化，從而降低超聲的提取效果，提取率反而下降。

表3 重復性實驗結果Table 3 Repeatability on Multi－frequency Ultrasound－assisted Extraction of Tea Polyphenols from Green Tea

圖5 循環速度對茶多酚提取率的影響Fig.5 The effect of cycle speed on the extraction rate of tea polyphenols

2.2 多頻超聲輔助提取茶多酚優化工藝研究

結果如表2所示。

表2 正交實驗結果表Table 2 The multi－frequency ultrasonic－assisted extracting the result of orthogonal text

由表2可知，經過均值和極差分析與比較，在選定范圍內，各因素對茶多酚提取率的影響順序為:D＞E＞A＞B＞C（功率＞頻率＞時間＞溫度＞料液比）;最佳提取工藝條件為:超聲提取（28kHz，200W），（33kHz，200W），（40kHz，200W），（60kHz，200W），提取時間20min，提取溫度65℃，料液比1∶70g/mL，循環速度1200r/min。

2.3 驗證實驗

通過實驗和分析，得出在最佳提取工藝條件下，多頻超聲波輔助法提取茶多酚的提取率和數據分析，見表3。

由表3可知，經過5次重復性實驗，所得到的提取率平均值為25.69%，標準方差為0.35%，相對標準偏差為0.23%，結果表明在最佳工藝條件下，多頻超聲輔助提取茶多酚的重復性好。

3 結論

在規定條件下，采用單因素實驗對多頻超聲輔助法提取茶多酚工藝的實驗結果表明:隨著料液比的降低，茶多酚提取率先增加后減少，超聲提取料液比為1∶70g/mL時，提取率最大;隨著超聲提取時間的增大，多頻超聲輔助法提取茶多酚的提取率先增大后降低，超聲提取20min時提取率便達到最大24.50%;在一定范圍內，提取溫度的升高可以加快茶多酚的溶解，但過高的溫度會加速茶多酚氧化，提取率反而有所下降，在60℃時提取率最大;超聲功率較小時，隨著超聲波功率的增大，茶多酚得率也隨之增大，200W時提取率最大24.63%，之后繼續增大超聲功率，提取率逐漸下降;隨著循環速度的提高，茶多酚的提取率總體趨勢隨著轉速的增加先升高后降低，1200r/min時，提取率最大。

利用正交實驗優化多頻超聲輔助法提取茶多酚工藝的實驗方案表明，各因素對茶多酚提取率的影響順序為:D＞E＞A＞B＞C（功率＞頻率＞時間＞溫度＞料液比）。多頻循環超聲輔助法提取比傳統浸提提取率高，在最佳工藝條件下的茶多酚提取率分別為25.69%、17.88%。與傳統的提取方法相比，多頻循環超聲輔助法提取的提取率提高了43.68%。多頻超聲輔助提取法提取茶多酚極大地提高了超聲場的利用效率，保證了物料的均勻破碎，減少了局部過度破碎現象，充分發揮了超聲波的空化效應、機械效應以及熱效應在茶多酚提取方面的作用，即可促進細胞破碎、加快傳質、加速反應，也可避免茶多酚在高溫下長時間氧化，保證了茶多酚的提取質量并提高了效率［28－29］。

［1］吳瓊潔，蔡碧瓊.茶多酚的研究進展及應用前景［J］.武夷科學，2005（12）:145－149.

［2］盛麗，任愛梅.天然抗氧化劑茶多酚［J］.化學教育，2004（11）:36－42.

［3］劉學銘，梁世中.茶多酚的保健和藥理作用及應用前景［J］.食品與發酵工業，1998（5）:49－53，73.

［4］王棟，康健.茶多酚的功效、提取和應用前景［J］.新疆大學學報:自然科學報，2007，24（2）:34－36.

［5］堯渝，江和源，袁新躍.茶葉功能成分提取制備專題（二）茶多酚的提取制備技術［J］中國茶葉專題綜述，2009（2）:11－13.

［6］芮璐.茶多酚的提取及其與人類健康的關系［J］.河北農業科學，2008，2（7）:170－172.

［7］王玉春.茶多酚的提取方法及應用研究進展［J］.甘肅聯合大學學報:自然科學版，2008，3（22）:51－55.

［8］劉世初，孫志洪，王斌.茶多酚的提取工藝及其應用機理研究進展［J］.家畜生態學報，2009，30（4）:91－94.

［9］耿文學，董華進.茶多酚免疫調節及抗腫瘤的研究進展［J］.實用癌癥雜志，2009，24（3）:315－317.

［10］Bose P C，Sen T C.Ultrasonic extraction of alkaloids from rauvolfia serpentine roots［J］.Indian J Pharm，1961，23（8）:222－223.

［11］Demagglo A E，Lott J A.Application of ultrasound for increasing alkaloid yield from Datura Stramoniun［J］.J Pharm Sci，1964，53（8）:945－946.

［12］趙兵，尹輝.循環超聲技術及其在中藥研發和生產中的應用［J］.中草藥，2006，37（1）:154－156.

［13］Liu W，Wang X.Extraction of flavone analogues from propolis with ultrasound［J］.Food Science，2004，25（6）:35－39.

［14］陳素艷，鄧清蓮，巫晶晶，等.超聲波法從茶葉中提取茶多酚［J］.渤海大學學報:自然科學版，2005，26（4）:316－319.

［15］GB/T 8302－2002.茶 取樣［S］.

［16］GB/T 8303－2002.茶磨碎試樣的制備及其干物質含量測定［S］.

［17］GB/T 8313－2002.茶 茶多酚測定［S］.

［18］劉玉德，曹雁平，夏閣堂.紅茶連續逆流浸取工藝研究［J］.北京工商大學學報:自然科學版，2003，3:10－13.

［19］曹雁平，劉玉德.用L型螺旋浸取器對綠茶進行連續逆流浸取工藝的研究［J］.食品科學，2001，11:43－46.

［20］劉玉德，曹雁平，張力.超聲波振蕩器在連續逆流螺旋浸取設備中的應用研究［J］.食品工業科技，2009（9）:259－261.

［21］何曉梅，曹偉.茶多酚超聲波輔助提取工藝條件優化研究［J］.湖南農業科學，2009（9）:111－113.

［22］陳勁春，李一，劉青秀.四種吸附材料分離茶多酚的初步結果比較［J］.北京化工大學報，2000，27（2）:95—96.

［23］尹蓮.超聲法提取茶多酚的實驗研究［J］.食品工業，1999（3）:10－11.

［24］劉蒙佳，陳錦屏.茶多酚提取方法的研究進展［J］.現代生物醫學進展，2006，6（7）:70—72.

［25］鄭海燕，張建新，劉麗麗，等.超聲波提取綠茶多酚的工藝研究［J］.西北農業學報，2009，18（2）:261－264.

［26］郭樹琴，吳勝舉，牛春玲，等.超聲提取綠茶茶多酚研究［J］.陜西師范大學學報:自然科學版，2009，36（1）:36－38.

［27］王寶金，吳長俊，房兆龍.竹葉茶多酚超聲提取及保險效果研究［J］.廣東農業科學，2013，40（10）:107－108.

［28］邵云飛，傅力，許明軍，等.速溶鳳凰單叢茶超聲波輔助浸提工藝優化［J］.食品與機械，3013，29（2）:113－116.

［29］王慧，蔣蓮芬，唐超，等.高山綠茶茶多酚提取工藝研究［J］.安徽農業科學，2012，40（7）:4007－4009.