軟骨細胞膜片修復山羊氣管的實驗研究

陶然 劉浥 陳潔 何愛娟 周廣東 曹誼林

2008年，Macchiarini等[1]采用“異體脫細胞氣管+自體骨髓間充質干細胞”構建了首例人組織工程氣管，并成功完成了人體移植，證實了組織工程方法構建人體氣道移植物的可行性。但該方法遠期效果并不理想[2]。研究發現，人脫細胞氣管在PBS里連續浸泡1年后其力學性能明顯下降[3]。因此，“異體脫細胞氣管+自體骨髓間充質干細胞”并非最理想的方法，還有很多困難需要克服。

本實驗室在前期研究中用“PGA支架+自體軟骨細胞”構建的組織工程氣管修復了兔長段氣管缺損，并實現了實驗動物的長期存活[4]。但是傳統的“支架材料+自體軟骨細胞”的模式因支架材料免疫排斥等在大動物模型上(山羊)無法成功，而無支架軟骨細胞膜片卻能在大動物體內形成健康成熟的軟骨組織[5]。由于氣道與外界連通，內壁有病原微生物附著，并在內外氣壓不斷變化下始終處于活動狀態。雖然軟骨組織對血供的要求較低，異位游離移植容易存活[6]。為了探索軟骨細胞膜片構建軟骨組織修復大動物氣管缺損的可行方式，我們設計了本實驗。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑

6只山羊(上海甲干生物科技有限公司)，平均體質量20.0±3 Kg。膜片體外培養6周后，將4張膜片重疊植入相應動物左側腹部皮下。膜片在體內培養8周后，將形成的組織取出，其中3例包裹在與實驗動物氣管直徑一致的硅膠管上，植入實驗動物頸部氣管旁肌肉中進行血管化及塑形(帶蒂移植組，PT組)；另外3例在腹部皮下培養16周后直接用于修復氣道缺損(游離移植組，DT組)。每組實驗動物均切除3個完整的氣管環。依照實驗動物保護指南，所有動物都獲得了人道主義對待。

胰蛋白酶(美國Hyclone公司)；Ⅱ型膠原酶(美國Worthington公司)；高糖DMEM(美國Gibco公司)；胎牛血清(美國Hyclone公司)。

1.2 原代細胞分離及擴增

原代細胞的獲取方法同前期實驗[5]。每只山羊取約2.0 cm×2.0 cm大小的耳廓軟骨，將軟骨塊剪碎，用0.25%胰蛋白酶震蕩消化30 min，加入0.15%Ⅱ型膠原酶，震蕩消化10～12 h。獲得的消化液用100 μm細胞濾網過濾后離心，去上清，沉淀的細胞用高糖DMEM重懸，混懸液按1×104cells/cm2的濃度接種在100 mm培養皿上。在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下，用含10%胎牛血清、2 ng/mL堿性成纖維細胞生長因子、1%青霉素及鏈霉素的DMEM培養基培養擴增，待軟骨細胞生長至70%～80%融合時進行傳代。

1.3 細胞膜片制備

在傳代過程中，留取一皿第2代細胞繼續培養，直至制備細胞膜片。將軟骨細胞培養至第4代，消化，離心，重懸，以8×105cells/cm2濃度接種于之前留取的第2代細胞上，以軟骨組織培養液培養，隔天換液。體外培養6周時可以于培養皿中揭起直徑100 mm的軟骨細胞膜片。每只實驗動物制作4張同樣大小的細胞膜片備用。

1.4 細胞膜片體內培養

麻醉實驗動物、備皮，取右側臥位，暴露左側腹部，在左側腹部作一約8 cm切口，進入皮下淺筋膜層，剝離皮下組織，術中妥善止血，保持術野干凈，形成能容納直徑100 mm細胞膜片的袋狀空腔。將體外培養6周的4張細胞膜片從培養皿上剝離，PBS洗凈，疊加在一起植入袋狀空腔中，無出血后分層縫合切口，術區用腹帶加壓包扎，7 d后拆除腹帶。

1.5 皮下形成組織頸部血管化及再塑形

對于帶蒂移植組，膜片在皮下培養8周后，將形成的組織取出，包裹在和羊氣管大小相近的硅膠管外，一同植入頸部氣管旁肌肉中，使其血管化和再塑形。對于游離移植組，膜片繼續在皮下培養至16周。

1.6 氣管缺損造模及氣道修復重建

對于帶蒂移植組，待軟骨片在頸部埋植8周后，將實驗動物全麻，仰臥位，行氣管插管術。直視下沿頸正中線切開皮膚，分離皮下組織直至暴露氣管。在氣管旁探查，暴露并游離組織工程軟骨，保留部分肌肉蒂。移除硅膠管，檢查組織工程軟骨管的強度和彈性。切除3個完整的氣管軟骨環，但是保留其后壁的平滑肌，然后用組織工程軟骨修復缺損。術后在修復段近心端吻合口下方2.5 cm處置入T型氣道支撐管，使T型管長端越過上端吻合口，以輔助吻合口渡過愈合期。

對于游離移植組，將體內培養16周的軟骨樣組織取出，同樣在保留氣管后壁平滑肌的基礎上切除3個完整的氣管軟骨環，然后用該軟骨樣組織游離移植修復缺損氣道，并置入T型管。

1.7 術后觀察及評估

術后評估實驗動物的整體健康狀況，重點關注氣道分泌物的量和顏色，以及實驗動物的呼吸狀況。如分泌物過多，或出現阻塞氣道的情況，可用吸痰管吸除分泌物，通暢氣道。在氣道重建術后14周拔出T型管。如拔管后實驗動物出現無法糾正的呼吸困難，按照善待實驗動物的規定，對其進行安樂死。

2 結果

體外培養6周后，從培養皿上能揭起完整的膜片，組織學染色可確定為較成熟的軟骨組織(圖1)。

將4張膜片疊加在一起植入動物腹部皮下。皮下培養8周后，6只實驗動物體內構建的組織大體觀察和組織學觀察都顯示明顯的軟骨組織特征，且構建的軟骨樣組織具有較好的彈性和韌性，能固定在硅膠管上(圖2)。

帶蒂移植組軟骨樣組織埋植在頸旁肌肉內8周后，和周圍的肌肉組織長在一起，形成了帶肌肉蒂的組織工程軟骨管。組織學發現該組織具有典型的軟骨特征，并和周圍的肌肉組織建立了血供。抽出硅膠管，軟骨管依然能保持通暢的管腔。切除3個完整的氣管軟骨環，用帶肌肉蒂的組織工程軟骨管修復氣管缺損。對于游離移植組，將腹部取出的軟骨片直接縫合在缺損段氣道上，缺損同樣為3個完整的氣管軟骨環(圖3)。

帶蒂移植組在氣道有T型管支撐的情況下能長時間存活(14周)，但在拔出T型管2周內均因嚴重的呼吸困難而死亡。呼吸困難的主要原因是氣道塌陷和內壁纖維結締組織增生。取材觀察發現，帶蒂移植組氣管修復段后壁明顯塌陷，塌陷處為頸部再血管化前，硅膠管上未被軟骨樣組織完全包裹的部位，而修復段縱切面內壁有嚴重的纖維結締組織增生，這是引起實驗動物出現呼吸困難的2個主要原因。雖然實驗動物沒能在拔出T型管后長期存活，但是我們發現修復段組織外壁為連續成熟的軟骨組織，且此處未發生明顯的塌陷，說明了氣道外壁的軟骨組織對維持氣道力學強度的重要性(圖4)。

雖然同樣在氣管修復術后置入了T型管，但游離移植組術后存活時間均小于2周，死亡原因主要是修復段組織壞死引起嚴重的局部感染，并有2例在修復段出現了氣管瘺。大體觀和組織學發現，該組修復段均為壞死組織或纖維結締樣組織，并伴有大量的炎癥細胞浸潤，僅能在局部觀察到小范圍散在的軟骨樣組織(圖4)。

圖1 體外培養的無支架軟骨細胞膜片及其組織學觀察(標尺:100 μm)Fig.1Gross and histological observation of chondrocytes cell-sheet(Bar:100 μm)

圖2 膜片體內培養8周的大體觀及組織學觀察(標尺:100 μm)Fig.2Gross view and histological observation of cell sheets after cultured in superficial fascia layer for 8 weeks in vivo(Bar:100 μm)

圖3 帶蒂修復組和游離移植組氣管缺損修復Fig.3Trachea reconstruction in both PT group and DT group

圖4 帶蒂修復組和游離移植修復組取材大體觀及組織學觀察(標尺:100 μm)Fig.4Gross and histological observation of reconstructed segments of each group(Bar:100 μm)

3 討論

長段氣管缺損一直是修復難點。當氣管缺損長度大于6 cm或多于4～5個氣管環的時候，就需要借助移植物來完成修復。目前臨床上尚無修復效果穩定可靠的移植物，而以自體細胞為種子細胞來源，采用組織工程學方法構建的軟骨組織具有排異反應小，能模擬氣道解剖學結構，實現氣道生理功能等優點。本實驗中所有膜片植入動物皮下后均形成了成熟的軟骨樣組織，說明無支架軟骨細胞膜片技術是一種穩定可靠的成軟骨方法，且軟骨樣組織在血供充足的條件下能滿足氣道修復的力學要求。

本實驗中，將腹部皮下形成的軟骨樣組織移植到頸旁肌肉后，軟骨組織并未出現缺血性壞死，其軟骨特征也沒發生明顯變化，這是因為軟骨組織與其他正常組織相比對血供營養的要求較低，所以游離移植的軟骨組織在和周圍組織建立血供的過程中不容易發生缺血性壞死[6]。但是，由于氣道是開放環境，其內壁有大量的病原微生物存在，且軟骨組織血供尚未完全建立，不具備足夠的抗病原微生物能力。如果將組織工程軟骨直接用于游離移植修復氣道缺損，可能在血供缺乏和病原微生物的雙重作用下發生壞死。游離移植組的結果證實了我們的推測。游離移植組修復段組織中僅能見到少量散在的軟骨組織，其余大部分為伴有大量炎癥細胞浸潤的壞死組織和纖維結締組織。而帶蒂移植組腹部皮下形成的組織工程軟骨游離移植到頸部后，并未發生缺血性壞死，組織學特征也未發生明顯變化。當抽出硅膠支撐管后，整個軟骨管保持了相當好的彈性和支撐力，能維持管腔通暢。但是，實驗初期我們遺漏了一個重要細節，在氣道修復手術時我們發現，帶蒂移植組第一只接受修復手術的動物，構建的軟骨管較其氣道直徑短約21%(此時羊氣道直徑約為14 mm，軟骨管直徑約為11 mm)。這是因為在組織工程軟骨管頸部再血管化時，實驗動物尚處于發育期，雖然當時構建的軟骨管和氣道直徑一致，但到8周后行氣管修復手術時軟骨管就相對偏細了。在后面的實驗中我們及時修正了這個問題，構建的軟骨管充分考慮了實驗動物的氣道發育問題。

術后帶蒂移植組能帶T管長期生存(14周)，但是一旦拔出T型管，實驗動物在2周內會出現逐漸加重的呼吸困難，并死亡(或被迫實行安樂死)。從修復段氣道取材大體結果來看，修復段后壁出現了嚴重的塌陷。此部位是頸部再血管化時硅膠管未被軟骨包裹的部位，而有軟骨包裹的部位(修復段前壁)卻保持了完好的弧形外表面。病理結果也顯示，修復段前壁有連續的軟骨樣組織，而后壁均為纖維結締組織。這也證實了軟骨化的外壁對維持氣道力學性能的重要性[7]。此外，修復段氣管大體觀和組織學均顯示管腔內纖維結締組織增生十分嚴重。研究認為，氣道內壁纖維結締組織增生和氣道上皮未覆蓋或上皮功能減退有很強的相關性[8-10]。氣道上皮的存在不僅可以降低細菌、真菌污染的概率，同時還能抑制纖維結締組織增生[7]。而且僅有軟骨外壁而無上皮化的內壁，這樣的結構也并不符合氣道的解剖學特點和生理學特性。所以，要成功修復長段氣管缺損，實現大型實驗動物長期存活，如何構建完整的軟骨外壁以及內壁提前(或盡快)上皮化將成為該方法最終能否成功的關鍵。目前，用組織工程技術構建了可以用來直接覆蓋氣道移植物內腔的組織工程上皮取得了不錯的效果[10-11]，提示可在修復手術前先實現軟骨管內壁上皮化，以有利于術后修復段氣管快速恢復功能，避免內壁纖維結締組織增生。另外，也有在氣管移植中把受體患者自體口腔黏膜上皮縫合在移植氣管內表面代替氣道上皮[6]。口腔黏膜上皮不僅能臨時替代氣道上皮，而且口腔黏膜成纖維細胞能顯著促進氣道上皮細胞的再生[8]，最后，這些非柱狀上皮的腔內覆蓋物在移植后會逐漸被受體氣管纖毛柱狀上皮所取代[12]。

綜上所述，我們認為①細胞膜片技術是一種穩定可靠的組織工程軟骨構建技術；②組織工程管狀軟骨的力學特性完全能滿足氣道修復的需要；③游離移植的軟骨組織在氣道的復雜環境中難以存活；④帶蒂移植修復是保證組織工程軟骨存活的關鍵因素。后續研究中，在構建軟骨管時，我們將保持其外壁的完整性，這需要進一步增大構建軟骨的尺寸；另外，應提前(或盡快)實現軟骨管內壁上皮化，這是避免內壁結締組織增生，維持管腔通暢的重要方法。

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