無血清培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療乙型肝炎肝硬化的臨床觀察

鄧福珠 畢曉云 何蓉 黃舒 陳晶礪 陳嘉榆 王恒湘 郭子寬

肝硬化是慢性乙型肝炎的常見并發(fā)癥，晚期出現(xiàn)肝功能的失代償，以門靜脈高壓和肝性腦病為主要病理基礎(chǔ)，表現(xiàn)為腹水、上消化道出血及神經(jīng)系統(tǒng)中毒癥狀。慢性乙型肝炎肝硬化是一種難治性疾病。近年來，抗病毒藥物已經(jīng)在慢性乙型肝炎中廣泛應(yīng)用，但是，阻滯體內(nèi)病毒復(fù)制，只能延緩肝硬化疾病進(jìn)程，而不能修復(fù)既有的肝細(xì)胞損傷。肝臟或肝細(xì)胞移植是解決該難題的有效手段，但由于肝臟及肝細(xì)胞供體缺乏，而乙型肝炎病毒可能在體內(nèi)持續(xù)存在，使移植受者繼發(fā)病毒性感染，至今仍未成為臨床治療的首選。

間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSC)是一種源于中胚層的成體干細(xì)胞，具有多向分化潛能和免疫調(diào)節(jié)能力，也可通過釋放膜微囊，將生物活性信號傳遞于受損細(xì)胞，從而參與多種組織的損傷修復(fù)過程[1-5]。基于此，MSC已經(jīng)被美國FDA批準(zhǔn)，開展150余項(xiàng)臨床試驗(yàn)研究。其中，有關(guān)自體或異體MSC治療肝臟纖維化或肝硬化項(xiàng)目26項(xiàng)，細(xì)胞應(yīng)用途徑包括外周靜脈輸注、門靜脈或肝動脈輸注等。已經(jīng)報導(dǎo)的臨床試驗(yàn)I～I(xiàn)I期結(jié)果表明，MSC治療肝硬化可改善部分參試者的肝臟功能，表現(xiàn)為凝血酶原和血清白蛋白濃度的升高，血清膽紅素濃度下降，并常伴隨腹水減少或消失[6-8]。值得注意的是，培養(yǎng)人MSC傳統(tǒng)體系為含胎牛血清的培養(yǎng)基；而在培養(yǎng)過程中，MSC可細(xì)胞內(nèi)化異種蛋白，每108個MSC中牛蛋白含量達(dá)到10～30 mg[9]。因此，傳統(tǒng)的MSC培養(yǎng)方式，不僅使患者暴露于罹患人畜共患病的風(fēng)險，也可能因移植細(xì)胞死亡釋放異體蛋白，引起血清病或其他免疫性疾病。此外，由于血清活性批次間的差異，培養(yǎng)細(xì)胞的穩(wěn)定性不確定。因此，利用無動物源蛋白分子、化學(xué)成份清楚的培養(yǎng)基擴(kuò)增MSC，對治療的安全性和有效性是十分必要的。本研究主要探討無血清培養(yǎng)人臍帶MSC的特性，以及應(yīng)用于肝硬化治療的安全性和有效性。

1 材料與方法

1.1 材料

人臍帶由空軍總醫(yī)院婦產(chǎn)科和廣州開發(fā)區(qū)醫(yī)院婦產(chǎn)科提供，符合實(shí)驗(yàn)用人體標(biāo)本管理規(guī)范。

無血清培養(yǎng)基(北京三有利生物技術(shù)有限公司)，人MSC培養(yǎng)專用胎牛血清(加拿大Stem Cell公司)，小鼠抗人CD14、CD31、CD44、CD45、CD73(美國BD公司)，維生素C、β磷酸甘油、地塞米松、胰島素、消炎痛、IMBX(美國Sigma公司)，兔抗人IgG、抗牛血清白蛋白抗體(美國Santa Cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 蛋白印跡雜交實(shí)驗(yàn)

BCA法測定人血清、胎牛血清和無血清培養(yǎng)基中的蛋白濃度。無血清培養(yǎng)基按照每道80 μg上樣，人血清上樣蛋白量分別為每道25 μg和50 μg，胎牛血清上樣蛋白量分別為每道6 μg、30 μg和60 μg。聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。含1%BSA的TBS緩沖液封閉過夜，加入抗人IgG重鏈或抗牛血清白蛋白抗體，室溫反應(yīng)2 h。洗滌后，加入抗辣根酶標(biāo)記的小鼠源抗兔抗體，室溫反應(yīng)30 min，化學(xué)發(fā)光法顯示結(jié)果。

1.2.2 人臍帶MSC的培養(yǎng)

[10]的方法，進(jìn)行人臍帶MSC的分離培養(yǎng)。收集人臍帶，PBS沖洗，去除臍靜脈、臍動脈和臍帶外膜，將組織剪碎，加入Ⅰ型膠原酶消化過夜。收集細(xì)胞，懸浮于人MSC無血清培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2培養(yǎng)5 d。吸除非貼壁細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞達(dá)80%融合，胰蛋白酶消化后傳代培養(yǎng)。第3～5代MSC用于治療。治療前48 h，取少量培養(yǎng)上清行細(xì)菌和真菌培養(yǎng)，取少量細(xì)胞行流式細(xì)胞學(xué)表面抗原分析。

1.2.3 流式細(xì)胞學(xué)鑒定

人臍帶MSC分別用無血清培養(yǎng)基和含10%FCS的α-MEM培養(yǎng)，PBS洗滌后加入PE標(biāo)記的小鼠抗人CD14、CD31、CD44、CD45和CD73單克隆抗體，室溫避光反應(yīng)20 min，PBS洗滌2次。流式細(xì)胞儀(FACSCalibur，BD)收集數(shù)據(jù)，WinMdi分析結(jié)果。

1.2.4 患者選擇

入組患者均符合中國《慢性乙型肝炎防治指南(2010)》診斷標(biāo)準(zhǔn)。入組條件為:①慢性乙型肝炎患者；②HBsAg和HBeAg均陽性；③存在肝性腦病、腹水、血清白蛋白濃度下降、總膽紅素升高、凝血酶原時間≥4 sec，或其中至少一項(xiàng)；④無嚴(yán)重心、肺及腎功能障礙。

本組共13例，其中男12例，女1例，年齡47～59歲，平均52.3±5.5歲。均為慢性乙型肝炎后肝硬化。Child-Turcotte-Pugh肝功能分級為B級11例，C級2例。本組患者均存在輕或中度黃疸，輕度腹水10例，肝性腦病(Ⅰ級)2例；均存在不同程度血清白蛋白濃度降低，凝血酶原時間≥4 sec患者5例。所有患者均簽署細(xì)胞治療知情同意書。

1.2.5 細(xì)胞治療及觀察

收集鑒定合格的人臍帶MSC，以含1%人白蛋白注射液的生理鹽水懸浮細(xì)胞，總體積為250 mL，細(xì)胞總數(shù)5.0×107個。細(xì)胞懸液由輸血器經(jīng)外周靜脈輸注，時間為30～60 min。細(xì)胞注射期間及24 h內(nèi)，監(jiān)測體溫、呼吸、血壓，實(shí)施心電監(jiān)護(hù)。細(xì)胞輸注每周1次，4次為一個療程。治療前后記錄癥狀變化，測定血清總膽紅素和白蛋白濃度，并檢測凝血酶原時間。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異采用t檢驗(yàn)，P0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 無血清培養(yǎng)條件下MSC的形態(tài)

經(jīng)膠原酶消化的臍帶細(xì)胞，在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，鏡下即可見貼壁細(xì)胞，呈紡錘形。72 h后，可見由數(shù)個細(xì)胞組成的小集落，呈放射狀分布(圖1)。

圖1 原代MSC形態(tài)觀察。Fig.1Morphological observation of primary MSCs

圖2 傳代培養(yǎng)的MSC形態(tài)觀察(100×)Fig.2Morphological observation of the passaged MSCs(100×)

繼續(xù)培養(yǎng)1周后，貼壁細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右進(jìn)行傳代培養(yǎng)，細(xì)胞仍維持成纖維細(xì)胞樣形態(tài)(圖2)。結(jié)果證明，利用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得細(xì)胞的形態(tài)，符合人MSC判定標(biāo)準(zhǔn)[11]。

2.2 MSC表面標(biāo)記分析

為鑒定無血清培養(yǎng)基分離培養(yǎng)的細(xì)胞，采用流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)，以血清培養(yǎng)的MSC作為參考，對細(xì)胞表面標(biāo)記進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，與常規(guī)體系培養(yǎng)的人臍帶MSC相似，無血清條件下培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)CD44和CD73，不表達(dá)CD14、CD31和CD45(圖3)，符合國際細(xì)胞治療協(xié)會的人MSC判定標(biāo)準(zhǔn)[11]。

圖3 MSC表面標(biāo)記分析Fig.3Analysis on the surface markers of MSCs

2.3 臨床觀察

本組患者共接受細(xì)胞輸注52次，細(xì)胞輸注期間及輸注后24 h內(nèi)均未出現(xiàn)發(fā)熱、頭痛等癥狀，心電監(jiān)護(hù)均未發(fā)現(xiàn)異常。

治療后，部分患者癥狀改善，包括食欲好轉(zhuǎn)(10例)、腹脹減輕(7例)、腹水減少(5例)和黃疸減輕或減退(11例)等。2例治療前存在肝性腦病患者，治療后神經(jīng)癥狀消失。治療后，血清總膽紅素濃度由(79.13±11.34)μM/L下降至(54.58±12.77)μM/L，差異顯著(P0.05)；血清白蛋白濃度(33.19±3.25 g/L)較治療前(32.02±4.17 g/L)略有升高(P0.05)，而凝血酶原時間(18.4±4.1 sec18.8±5.6 sec)無明顯變化。Child-Turcotte-Pugh評分(8.1±1.4)較治療前(8.5±1.5)減低，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。

3 討論

作為一種細(xì)胞藥物，MSC已進(jìn)入臨床應(yīng)用階段，用于治療兒童移植物抗宿主病、骨關(guān)節(jié)疾病及克隆氏病腸瘺等[12]。此外，美國FDA已經(jīng)批準(zhǔn)了多項(xiàng)MSC治療肝臟纖維化的臨床試驗(yàn)。然而，目前多采用含動物或人血清的體系用于骨髓或臍帶MSC的培養(yǎng)，臨床應(yīng)用存在安全隱患，尤其是某些動物或人病毒性疾病傳播。因此，采用化學(xué)成份清晰、無血清且無異種蛋白的體系進(jìn)行MSC培養(yǎng)，對于保障MSC治療的安全性是十分必要的[13]。

無血清培養(yǎng)人MSC已有大量的深入研究，如培養(yǎng)體系中加入細(xì)胞生長因子[14]或微量元素[15]，或多種細(xì)胞生長因子組合[16]，或?qū)?xì)胞培養(yǎng)材料進(jìn)行表面修飾[17]等。然而，相比含血清體系培養(yǎng)的MSC，由于無血清條件下細(xì)胞代謝的特殊性，所獲得的MSC在表型及功能上都可能存在差異[18]。本研究結(jié)果表明，經(jīng)無血清條件培養(yǎng)的人臍帶MSC，形態(tài)呈纖維細(xì)胞樣，高表達(dá)CD44和CD73，不表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記CD31和血細(xì)胞標(biāo)記CD14、CD45，符合體外培養(yǎng)的人MSC最低鑒定標(biāo)準(zhǔn)[11]。

近年來，對MSC修復(fù)肝臟損傷及抗肝纖維化的機(jī)制進(jìn)行了研究。MSC經(jīng)靜脈輸注后，主要經(jīng)肺循環(huán)進(jìn)入肝臟和脾臟，這是MSC治療肝損傷的細(xì)胞動力學(xué)基礎(chǔ)。同位素標(biāo)記MSC后掃描發(fā)現(xiàn)，輸注的細(xì)胞首先到達(dá)肺臟，之后轉(zhuǎn)移至肝臟和脾臟；其中，輸注10 d后，肝臟存在的細(xì)胞占總細(xì)胞量13%以上[19]。進(jìn)入肝臟的MSC，可能在肝臟微環(huán)境的誘導(dǎo)下，分化為功能性的肝細(xì)胞[20]，或與受損肝細(xì)胞融合，獲得并行使肝細(xì)胞的部分功能[21]。移植至肝臟的MSC，或可促進(jìn)周圍細(xì)胞金屬硫蛋白酶的分泌，以降解周圍膠原組織；也可能抑制腫瘤壞死因子和轉(zhuǎn)化生長因子的分泌，阻斷肝臟纖維化過程[22-23]。MSC治療肝臟纖維化的臨床試驗(yàn)也表明，細(xì)胞治療后部分患者出現(xiàn)肝功能改善，血清白蛋白濃度升高，總膽紅素下降，腹水減輕或消失[6-8]。本組患者經(jīng)臍帶MSC治療4次后，血清總膽紅素濃度明顯降低，但血清白蛋白濃度和凝血酶原時間并無顯著變化，可能與患者數(shù)較少，觀察時間較短有關(guān)。另外，本組患者均未出現(xiàn)發(fā)熱、頭痛等癥狀，心電監(jiān)護(hù)也未發(fā)現(xiàn)異常，提示使用該劑量(每次5×107個)未發(fā)生急性毒性，治療過程安全順利。

總之，使用無血清培養(yǎng)人臍帶MSC，可保持細(xì)胞的固有特性，臨床應(yīng)用未發(fā)現(xiàn)急性毒性。進(jìn)一步長期隨訪觀察將有助于闡明治療方式的有效性。

參考文獻(xiàn)

[1]王恒湘,郭子寬.間充質(zhì)干細(xì)胞在組織工程應(yīng)用中的諸多問題[J].組織工程與重建外科,2008,4(5):241-245.

[2]王東梅,郭子寬.新型干細(xì)胞治療:科學(xué)和政策[J].組織工程與重建外科,2008,7(2):61-64.

[3]郭子寬,王立生,吳祖澤.間充質(zhì)干細(xì)胞在組織再生和免疫調(diào)節(jié)治療中的應(yīng)用[J].中國醫(yī)藥生物技術(shù)雜志,2006,1(1):58-61.

[4]Zhang HC,Liu XB,Huang S,et al.Microvesicles derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells stimulated by hypoxia promote angiogenesis both in vitro and in vivo[J].Stem Cells Dev,2012,21(18):3289-3297.

[5]Pittenger MF,Mackay AM,Beck SC,et al.Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells[J].Science,1999,284(1):143-147.

[6]El-Ansary M,Abdel-Aziz I,Mogawer S,et al.Phase II trial:undifferentiated versus differentiated autologous mesenchymal stem cells transplantation in Egyptian patients with HCV induced liver cirrhosis[J].Stem Cell Rev,2012,8(3):972-981.

[7]Kharaziha P,Hellstrom PM,Noorinayer B,et al.Improvement of liverfunctioninlivercirrhosispatientsafterautologous mesenchymal stem cell injection:a phase I-II clinical trial[J].Eur J Gastroenterol Hepatol,2009,21(10):1199-1205.

[8]Mohamadnejad M,Alimoghaddam K,Mohyeddin-Bonab M,et al.Phase I trial of autologous bone marrow mesenchymal stem cell transplantation in patients with decompensated liver cirrhosis[J].Arch Iran Med,2007,10(4):459-466.

[9]Spees JL,Gregory CA,Singh H,et al.Internalized antigens must be removed to prepare hypoimmunogenic mesenchymal stem cells for cell and gene therapy[J].Mol Ther,2004,9(5):747-756.

[10]劉靜,韓冬梅,薛梅,等.臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞輸注治療頑固性潰瘍性結(jié)腸炎[J].組織工程與重建外科雜志,2011,7(5):258-260.

[11]Dominici M,Le Blanc K,Mueller I,et al.Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells.The International Society for Cellular Therapy position statement[J].Cytotherapy,2006,8(4):315-317.

[12]Battiwalla M,Hematti P.Mesenchymal stem cells in hematopoietic stem cell transplantation[J].Cytotherapy,2009,11(5):503-515.

[13]Meuleman N,Tondreau T,Delforge A,et al.Human marrow mesenchymal stem cell culture:serum-free medium allows better expansion than classical alpha-MEM medium[J].Eur J Haematol,2006,76(2):309-316.

[14]Wang X,Zheng F,Liu O,et al.Epidermal growth factor can optimize a serum-free culture system for bone marrow stem cell proliferation in a miniature pig model[J].In Vitro Cell Dev Biol Anim,2013,49(10):815-825.

[15]畢曉云,黃舒,郭杰,等.鋅離子促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖并增強(qiáng)其纖黏連蛋白表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究[J].組織工程與重建外科,2013,9(2):81-84.

[16]Chase LG,Yang S,Zachar V,et al.Development and characterization of a clinically compliant xeno-free culture medium in good manufacturing practice for human multipotent mesenchymal stem cells[J].Stem Cells Transl Med,2012,1(10):750-758.

[17]Dolley-Sonneville PJ,Romeo LE,Melkoumian ZK.Synthetic surface for expansion of human mesenchymal stem cells in xeno-free,chemically defined culture conditions[J].PLoS One,2013,8(8):e70263.

[18]Mark P,Kleinsorge M,Gaebel R,et al.Human mesenchymal stem cells display reduced expression of CD105 after culture in serum-free medium[J].Stem Cells Int,2013,2013:ID698076.

[19]Gholamrezanezhad A,Mirpour S,Bagheri M,et al.In vivo tracking of111In-oxinelabeledmesenchymalstemcellsfollowing infusion in patients with advanced cirrhosis[J].Nucl Med Biol,2011,38(7):961-967.

[20]Hwang S,Hong HN,Kim HS,et al.Hepatogenic differentiation of mesenchymal stem cells in a rat model of thioacetamideinduced liver cirrhosis[J].Cell Biol Int,2012,36(3):279-288.

[21]Cho JW,Lee CY,Ko Y.Therapeutic potential of mesenchymal stem cells overexpressing human forkhead box A2 gene in the regeneration of damaged liver tissues[J].J Gastroenterol Hepatol,2012,27(8):1362-1370.

[22]Iwamoto T,Terai S,Hisanaga T,et al.Bone-marrow-derived cells cultured in serum-free medium reduce liver fibrosis and improve liver function in carbon-tetrachloride-treated cirrhotic mice[J].Cell Tissue Res,2013,351(3):487-495.

[23]Tanimoto H,Terai S,Taro T,et al.Improvement of liver fibrosis by infusion of cultured cells derived from human bone marrow[J].Cell Tissue Res,2013,354(3):717-728.