環狀排列黃色熒光蛋白在大腸桿菌及畢赤酵母中表達的比較研究

孫金鈺，鄭屹峰，巫啟明，郭建輝，林春通，劉樹滔，饒平凡

(福州大學生物工程研究所，福建福州 350002)

0 引言

自由基的體內生物學作用是近年來的研究熱點，然而自由基在體內的半衰期非常短，穩態濃度極低，使得自由基的檢測較為困難，這也在很大程度上限制了人們對自由基體內生物學作用的深入研究［1］.目前，熒光法結合共聚焦顯微成像技術和微區光譜檢測技術，是能實現生物體內自由基“實時、可視、定量”檢測的最主要方法［2］.因此，可特異性識別自由基并快速響應的熒光探針的開發顯得尤為重要［3］，是實現生物體內自由基動態監測的關鍵所在.

環狀排列黃色熒光蛋白(circularly permuted yellow fluorescent protein，cpYFP)是YFP的一種突變體——EYFP(V68L/Q69K)，即通過一段鏈接多肽Linker(VDGGSGGTG)連接YFP的N端和C端，使YFP一級結構氨基酸序列的145位酪氨酸(Y)和144位天冬氨酸(N)成為新的融合蛋白的N端和C端［4－5］.程和平［6］等的最新研究發現cpYFP是一種新型的超氧陰離子自由基(O2－)熒光蛋白探針，當線粒體中O2－大量產生時，cpYFP出現熒光強度增強的“超氧炫”現象，通過這種熒光強度的改變大小，可實現O2－實時檢測，因此預測其可作為多種氧化應激相關疾病的指標.雖然有些學者認為cpYFP對pH敏感，這種“超氧炫”現象也可能是線粒體瞬間堿化引起的［7－8］，但最新的研究表明，伴隨著“超氧炫”現象的線粒體基質堿化極小(ΔpH＜0.1)，僅憑這樣微小的變化無法引起cpYFP熒光強度的明顯增強，只有O2－存在時才能出現這樣變化，且cpYFP對O2－特異性強、靈敏度高、能實現細胞內O2－的實時檢測，從而確認了cpYFP可作為O2－的特異熒光探針［9－10］.由于cpYFP能滿足自由基生物學與醫學深入研究的需求，科研工作者期待能夠方便地獲得cpYFP.

cpYFP已成功在基因工程轉化的大腸桿菌中表達，其理化性質也得到初步表征.例如，程和平［6］所構建pPSET－cpYFP重組載體在E.coli.(BL21(DE3)LysS)中的成功表達.然而，大腸桿菌表達體系存在諸多不足，如無法對表達的目的蛋白進行加工修飾，產生內毒素且胞內表達產物多以包涵體形式存在不利于分離純化等.相反，甲醇營養型畢赤酵母兼具了真核及原核表達體系的優點，可對蛋白進行二硫鍵的形成、糖基化修飾等加工，還可根據載體特點通過引物設計實現目的蛋白胞外分泌，有利于目的蛋白的分離純化，更好地滿足工業化生產的要求［11］.同時cpYFP在真核表達體系中的表達尚無報道.因此，本實驗嘗試通過構建cpYFP的重組質粒，實現cpYFP在畢赤酵母中的表達，并與cpYFP在大腸桿菌表達體系進行比較，以期獲得高效表達目的蛋白且易于分離純化的重組菌株.

1 材料與方法

1.1 菌株與質粒

pMD18 －T Simple Vector購自 TaKaRa公司;E.coli.(JM109)、E.coli.(BL21(DE3))、Pichia.(X33)及表達載體pET21a(+)、pPICZαA為福州大學生物工程研究所保存.

1.2 主要藥品與試劑

DNA marker DL5000、DL2000、限制性內切酶EcoRⅤ、HindⅢ、EcoRⅠ、XbaⅠ和XhoⅠ等購自TaKa-Ra公司;UNIQ－10柱離心式質粒小量抽提試劑盒、瓊脂糖膠回收試劑盒、Protein Molecular Weight Marker等購自上海生工生物工程公司;IPTG、酵母提取物及胰蛋白胨等為Sigma公司產品;乙醇、甲醇等試劑藥品均為分析純.

1.3 實驗方法

1.3.1 表達載體的構建

表1 cpYFP引物Tab.1 The primers of cpYFP

由北京大學分子醫學研究所程和平實驗室饋贈的含 cpYFP基因(807 bp)的 pShuttle－CMV質粒驗證后，通過設計引物，引入酶切位點(見表1，下劃線部分)，原核引物為P1和P2，真核引物S1在引入酶切位點的同時引入2個堿性氨基酸 Lys和 Arg(見表1，字體加粗處)，以實現目的蛋白的胞外分泌，S2在引入酶切位點的同時添加兩個堿基(表中字體加粗處)，以便和表達載體上對應序列互補，使目的蛋白能連上表達載體的c－myc epitope和His－Tag，為后期蛋白活性驗證及分離純化帶來方便.回收目的片段連接至pMD18－T載體上，雙酶切、PCR驗證及核酸序列測定.將測序后未發生突變的且用于原核構建的亞克隆命名為PT，真核的命名為ST.

將PT質粒經EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切膠回收目的片段并與經過相同處理的原核表達載體pET21a(+)連接后轉化進入E.coli.(JM109)，提取質粒經雙酶切及PCR驗證篩出目的菌株，然后將重組質粒轉化進入大腸桿菌表達菌株E.coli.(BL21(DE3))，雙酶切及PCR驗證.

選擇XhoⅠ和XbaⅠ限制性內切酶用同樣的方法將ST質粒與真核表達載體pPICZαA連接后轉入E.coli.(JM109)中擴增，驗證后將重組質粒線性化電轉入畢赤酵母表達菌株Pichia.(X33)，提取酵母基因組DNA經PCR驗證篩出目的菌株.

1.3.2 目的蛋白的表達

1.3.2.1 目的蛋白在大腸桿菌中的表達

將重組菌株E.coli.(BL21(DE3))置于LB培養基中，37℃，搖培至OD600=0.8～1.0，開始誘導加入IPTG至終濃度1 mmol·L－1，誘導6 h.12 000 r/min離心10 min，棄上清，加入TE緩沖液輕懸菌體，SDS－PAGE觀察分析.同時488 nm激光共聚焦成像，觀察是否有菌株及是否有熒光.

1.3.2.2 目的蛋白在畢赤酵母中的表達

將重組菌株Pichia.(X33)置于YPD培養基中，30℃，搖培24 h后，按1%的接種量轉接至YP培養基中培養，待OD600=3.0～5.0開始誘導(誘導前取樣)，按1%(體積百分比)的誘導劑量添加甲醇，每隔24 h補加甲醇至終濃度1%，誘導3 d.12 000 r/min離心10 min，收集上清，SDS－PAGE觀察分析.同時488 nm激發，525 nm濾光片暗室拍照觀察表達產物是否具有熒光.

1.3.3 目的蛋白的熒光強度測定與分析

從重組大腸桿菌表達菌株保種平板上，挑取多個單菌落，在相同條件下培養并誘導表達，收集菌體，溶解在10.0 mL的PBS(0.1 mol·L－1pH 8.4)緩沖液中，超聲破碎30 min，測定并比較熒光強度大小，從而篩出高表達量菌株.

從重組畢赤酵母表達菌株保種平板上，挑取多個單菌落，在相同條件下培養和誘導表達.離心收集上清，80%乙醇沉降，去除大部分色素(色素去除率分析方法參見文獻［12］)，減少發酵液色素對測定結果的影響.將沉淀溶于相同的PBS緩沖液中，共得10.0 mL樣品溶液，測定并比較熒光強度大小，篩選出高表達量的重組畢赤酵母.

cpYFP的激發光488 nm，發射光515 nm［6］，通過熒光分光光度計進行測定(狹縫寬度:10 nm×10 nm，電壓:650 V，488 nm激發，500～700 nm全波段掃描).為了驗證cpYFP對O－2的識別，通過構建簡單的產生O－2的體系，即黃嘌呤(X)與黃嘌呤氧化酶(XO)反應［13］.本實驗調整大腸桿菌及畢赤酵母表達的cpYFP的熒光強度，各取100 μL溶液，加入黃嘌呤(25 mmol·L－1)與黃嘌呤氧化酶(25 mU)各50 μL，37℃反應10 min后測定并觀察熒光強度，對照組加入等量的PBS，對比分析反應前后的熒光強度的變化.

2 結果與分析

2.1 表達載體的構建與驗證

圖1 重組質粒的驗證電泳圖Fig.1 PCR and enzyme digestion identification of the recombination

圖2 酵母基因組PCR驗證電泳圖Fig.2 PCR identification of Pichia＇s gene

以pET21a(+)為原核表達載體，構建cpYFP基因大腸桿菌表達質粒，雙酶切及PCR驗證(如圖1(a)所示)，表明目的片段已成功連接至表達載體上.用同樣的方法驗證目的基因已接至真核載體pPICZαA上(如圖1(b)所示)，將質粒線性化后電轉化進入畢赤酵母 X33中，提取酵母基因組 DNA，PCR驗證(見圖2).

圖3 大腸桿菌cpYFP電泳圖像Fig.3 Figure of SDS － PAGE analysis of cpYFP producted by E.coli.

2.2 cpYFP的誘導與表達

圖3為大腸桿菌胞內表達產物的SDS－PAGE電泳圖，由圖3結果可知，在分子量為30.83 kD(cpYFP理論分子量)處，誘導前，無蛋白條帶，經IPTG誘導后，出現蛋白條帶且該條帶隨誘導時間的增加逐漸加深.激光共聚焦顯微(488 nm激發)照片(圖4)也顯示E.coli.菌株的表達產物，具有清晰可見的黃綠色熒光，進一步證實該菌株確實表達了cpYFP.

畢赤酵母經甲醇誘導后表達產物的SDS－PAGE見圖5.由于誘導前蛋白含量較低，為了更好比較誘導前后蛋白表達情況，采用硝酸銀染色.由圖可知，誘導前未表達cpYFP，誘導后出現cpYFP的蛋白條帶(圖5方框部分)，且蛋白條帶伴隨著誘導時間的增加而逐漸加深，經測算，畢赤酵母表達的cpYFP的相對分子量為43.95 kD，較理論分子量(32.52 kD)偏大.熒光成像結果顯示，誘導前畢赤酵母表達產物無熒光(圖片未列出)，經甲醇誘導后表達產物具有明顯的黃綠色熒光，說明該菌株確實表達了cpYFP(圖6).

圖4 重組cpYFP在大腸桿菌中表達的共聚焦圖像Fig.4 Figure of confocal microscope of the E.coli.

圖5 畢赤酵母cpYFP電泳圖Fig.5 Figure of SDS － PAGE analysis of cpYFP

圖6 酵母重組cpYFP自然光及熒光圖像Fig.6 Natural light and Fluorescence picture of cpYFP

2.3 畢赤酵母表達產物色素去除

畢赤酵母發酵過程中容易產生一些非蛋白類物質，如色素，多糖等.色素類物質的存在會影響下游蛋白的分離純化，且可能干擾表達產物的熒光強度的測定，因此，在進行熒光強度測定之前，本文首先通過乙醇沉降的方法，去除表達產物中的各種色素成分，結果見表2.通過測定乙醇沉降前后發酵液在400 nm及490 nm下吸光值的變化來分析發酵液的脫色率，結果表明，80%的乙醇沉降處理，可以去除69.69%的色素，這大大減小了色素對測定結果的影響.

表2 色素去除分析Tab.2 The analysis result of decoloration

表3 大腸桿菌與畢赤酵母cpYFP表達量的比較Tab.3 Compare of the cpYFP expressionquantity of Ecoli.and Pichia.

2.4 cpYFP的熒光強度測定與比較分析

通過大量篩菌，分別從重組大腸桿菌和畢赤酵母中篩選出表達量高的菌株，再將它們分別誘導表達，測定熒光強度，結果見表3.表中數據表明畢赤酵母重組cpYFP的熒光強度約為大腸桿菌表達的的3倍.

2.5 cpYFP的活性檢測與比較分析

cpYFP作為O－2熒光探針，當與O－2共存時，熒光強度增強.在cpYFP中加入黃嘌呤(X，25 mmol·L－1)與黃嘌呤氧化酶(XO，25 mU)反應后測定并觀察熒光強度的變化.當加入O－2重組畢赤酵母表達的cpYFP的熒光強度發生明顯的變化，與對照組相比約增強了3.7倍，驗證了重組cpYFP對 O－2的識別(圖7(a)).而大腸桿菌表達的cpYFP與O－2反應熒光強度約增強了1.9倍(圖7(b).可見畢赤酵母重組cpYFP較大腸桿菌表達的cpYFP具更高的靈敏性.本實驗表明畢赤酵母表達體系較大腸桿菌表達體系具優越性，可作為制備cpYFP的良好系統.

圖7 cpYFP的活性檢測Fig.7 The activity assay of cpYFP

3 討論

cpYFP的激發光為488 nm，可簡單通過激光共聚焦顯微鏡或濾光片進行觀察，其區分度高.cpYFP對超氧陰離子自由基特異識別，還可通過熒光分光光度計直接測定其熒光強度，從而實現O－2的定量檢測，解決了自由基測定的難題.目前，已有學者將其用作骨骼肌活動與疾病的生物探針［14］，以及用于亨廷頓舞蹈病中線粒體DNA損傷的測定研究［15］等.

本實驗首次實現了cpYFP在畢赤酵母的胞外表達.由于文獻中未見重組大腸桿菌cpYFP表達量的報道，因此，我們僅將本文所構建的重組畢赤酵母與重組大腸桿菌對比.結果表明，畢赤酵母胞外分泌目的蛋白不僅表達量高且雜質少，為其廣泛的應用奠定了基礎.

實驗得到的酵母重組cpYFP的分子量(43.95 kD)較理論分子量(32.52 kD)偏大，這可能是畢赤酵母表達的cpYFP經翻譯后加工，如糖基化、甲基化等，分子量變大;且cpYFP也可能與多糖或其他產物以非共價鍵的形式結合，從而導致cpYFP在SDS－PAGE上對應的蛋白條帶相對分子量偏大.但其真實原因，還有待進一步的實驗驗證.此外，本文研究結果表明，不管是翻譯后修飾或是和多糖或其他物質結合，似乎并不影響cpYFP的生物學活性，重組cpYFP仍然表現出明顯的熒光性，且對O－2敏感.

本實驗雖然實現了畢赤酵母發酵獲取cpYFP，但發酵條件的優化仍需繼續進行，我們期待通過優化發酵條件以提高表達量，為cpYFP的分離純化、性質表征及其應用提供充足的原料.

［1］趙保路.電子自旋共振技術在生物和醫學中的應用［M］.合肥:中國科學技術大學出版社，2009:56－66.

［2］高靜靜.用于檢測生物體內活性物質的新型熒光探針的設計合成及其應用［D］.濟南:山東師范大學，2007.

［3］Kalyanaraman B，Darley－ Usmar V，Kelvin J A D，et al.Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes:challenges and limitations［J］.Free Radical Biology ＆ Medicine，2012，52:1 －6.

［4］Nagai T，Sawano A，Park E S，et al.Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2+［J］.Proceedings of the National Academy of the United States of America，2001，98(6):3 197－3 202.

［5］Quatresous E，Legrand C，Pouvreau S.Mitochondria－targeted cpYFP:pH or superoxide sensor［J］.Journal of General Physiology，2012，104(5):567－570.

［6］Wang Wang，Fang Huaqiang，Groom L，et al.Superoxide flashes in single mitochondria［J］.Cell，2008，134:279 －290.

［7］Schwarzlander M，Logan D C，Fricker M D，et al.The circularly permuted yellow fluorescent protein cpYFP that has been used as a superoxide probe is highly responsive to pH but not superoxide in mitochondria:implications for the existence of superoxide‘flashes’［J］.Biochem，2011，437:381－387.

［8］Schwarzlander M，Murphy M P，Duchen M R，et al.Mitochondrial‘flashes’:a radical concept rephined［J］.Trends in Cell Biology，2012，22(10):503－508.

［9］Lan Wei－ LaPierre，Gong Guohua，Gerstner B J，et al.Respective contribution of mitochondrial superoxide and pH to mtcpYFP flash activity［J］.The Journal of Biological Chemistry，2013，288:10 567 － 10 577.

［10］Zhang Xing，Huan Zhanglong，Hou Tingting，et al.Superoxide constitutes a major signal of mitochondrial superoxide flash［J］.Life Sciences，2013，93(40):178 －186..

［11］Lin G P C，Lin J C，Ilgen C，et al.Production of recombinant proteins in fermenter cultures of yeast pichia pastoris［J］.Current Opinion in Biotechnology，2002，13:329－332.

［12］呂蕾，郭志軍，胡耀輝.打孔樹脂對茁霉多糖發酵液色素吸附性能的研究［J］.食品與發酵科技，2009，45(4):39－41.

［13］Kaneyuki T，Noda Y，Traber M G，et al.Superoxide anion and hydroxyl radical scavenging activities of vegetable extracts measured using electrion spin resonance［J］.Biochemistry and Molecular Biology International，1999，47(6):979 －989.

［14］Wei Lan，Salahura G，Boncompagni S，et al.Mitochondrial superoxide flashes:metabolic biomarkers of skeletal muscle activity and disease［J］.The FASEB Journal，2011，25:3 068 －3 078.

［15］Wang Jiuqiang，Chen Qian，Wang Xianhua，et al.Dysregulation of mitochondrial calcium signaling and superoxide flashes cause mitochondrial genomic DNA damage in Huntington Disease［J］.The Journal of Biological Chemistry，2013，288:3070 －3084.