八肽膽囊收縮素及其受體拮抗劑對嗎啡戒斷大鼠腦內［Ca2+］i和CaM活性的影響

張雅靜，馬興友，文 迪，楊勝昌，于 峰，董 玫，馬春玲，叢 斌

(1.河北醫科大學法醫系，河北省法醫學重點實驗室，河北石家莊 050017;2.石家莊市第一醫院腫瘤內科，河北石家莊 050011;3.邢臺醫學高等?？茖W校第二附屬醫院，河北邢臺 054000)

八肽膽囊收縮素(cholecystokinin，CCK-8)是廣泛存在于中樞和周圍神經系統的一種神經肽，其通過CCK1及CCK2兩種不同的受體亞型參與調節疼痛、焦慮、學習和記憶等過程。我室前期研究發現CCK-8對阿片成癮過程具有明顯的調節作用［1］。Ca2+-CaM-CaMK是藥物成癮過程中除AC-PKA之外另一條重要的信號轉導通路，在嗎啡依賴和戒斷過程中起著重要作用［2］。本實驗通過建立嗎啡戒斷大鼠模型，采用流式細胞術檢測大鼠皮質、海馬和紋狀體內［Ca2+］i和CaM活性，探討CCK-8及其受體拮抗劑參與調節嗎啡依賴及戒斷過程的細胞信號機制，為CCK-8在戒毒方面的應用提供相關實驗依據。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑 鹽酸嗎啡(morphine hydrochloride，Mor)為沈陽第一制藥廠產品;CCK-8、納洛酮(naloxone，Nal)購自美國Sigma公司，CCK1受體拮抗(L-364，718)和 CCK2受體拮抗劑(LY-288，513)購自英國Tocris公司，三氟拉嗪(TFP)購自瑞士A-lexis公司，Fluo3-AM和F-127購自DOJINDO公司;FACS Calibur型流式細胞儀為美國BD公司產品。

1.2 動物分組及給藥方式 清潔級健康♂ Wistar大鼠42只，體質量190～210 g，由河北省實驗動物中心提供。實驗前適應性飼養 1周，室溫 (22±1)℃，濕度50%，自然晝夜循環非直接光照條件生活，通風良好，自由攝食、飲水。適應性飼養1周后，參照文獻建立大鼠慢性嗎啡依賴及急性催促戒斷模型:以劑量遞增法連續皮下注射嗎啡 (10、20、30、40、50 mg·kg－1)5 d，每天 2 次，間隔12 h(8 ∶00、20∶00)，記錄每日大鼠體重變化。d 6，8∶00皮下注射嗎啡50 mg·kg－1，2 h后腹腔注射鹽酸納絡酮(5 mg·kg－1)進行催促戒斷，記錄戒斷后15 min大鼠跳躍次數及1 h后體重變化。然后用改良Gellert-Holtzman法評價模型建立是否成功，剔除未成模動物。具體分組如下，①鹽水對照組(Control):背部皮下注射同等劑量的生理鹽水;②嗎啡依賴組(Mor):按照上述方案進行嗎啡皮下注射;③戒斷組(Nal):按照上述方案嗎啡皮下注射后2 h進行納絡酮催促戒斷;④－⑥慢性藥物干預組(CCK-8/L-364，718/LY-288，513):給予嗎啡前 30 min 分別腹腔注射 CCK-8(50 μg·kg－1)，L-364，718(1 mg·kg－1)，LY-288，513(1 mg·kg－1)，余同③;⑦溶劑對照組(Vehicle):給予嗎啡前30 min，注射同等體積的溶劑 (DMSO ∶1，3-丙二醇 =1 ∶4，1 ml·kg－1)，余同③。

1.3 大鼠神經細胞的急性分離 實驗結束后大鼠行斷頭術，取腦放入定位模具內，參照大鼠腦立體定位圖譜 (Paxinos and Watson，1998)，冰浴下分離額葉皮質、海馬和紋狀體，立即置于4℃預冷的含10%胎牛血清的DMEM培養基中。參照文獻制備單細胞懸液，方法如下:剔除軟腦膜和血管，用無鈣鎂Hanks液清洗后，將組織充分剪碎，研磨，過200目篩網，再過400目篩網去除團塊，將濾液離心(4℃，1 000 r·min－1，10 min)，收集沉淀，用 Hanks液洗滌1次，最后調整細胞濃度到1 ×1010～2×1010個·L－1，用臺盼藍染色鑒定細胞活性，細胞活性大于90%可用于［Ca2+］i及CaM活性的測定。

1.4 細胞內 ［Ca2+］i的測定 取400 μl上述細胞懸液，加入2 μl Fluo-3 AM(終濃度 5 μmol·L－1)和2 μl F-127(終濃度 0.05%)，于 37℃ 恒溫箱中負載30～40 min，負載后的細胞用無鈣鎂液Hanks洗滌2次。每份標本用流式細胞儀測定10 000個細胞的平均熒光強度(average of fluorescent intensity)，以反映［Ca2+］i的變化。

1.5 CaM活性的測定 取400 μl上述細胞懸液，加入1 ml預冷的70%乙醇進行固定，4℃ 過夜。然后用無鈣PBS洗滌3次，加入1 mmol·L－1三氟拉嗪2 ml振蕩混勻，用250～256 nm紫外光照射20 min。每份標本用流式細胞儀測定10 000個細胞的平均熒光強度，用以反映CaM活性的變化。

1.6 統計學處理 采用 SPSS 10.0數據統計軟件處理，以對照組的平均熒光強度為標準，其余各組與之相比，再次計算的比值作為統計值±s，結果行單因數的方差分析(ANOVA)，用最小顯著差法(least significant difference，LSD)做兩兩比較。

2 結果

2.1 CCK-8及其受體拮抗劑對神經細胞內［Ca2+］i的影響 嗎啡依賴大鼠在給予納絡酮催促戒斷后，觀察到齒顫、濕狗樣抖動、腹瀉、流淚、流涎、跳躍、體重明顯下降等戒斷癥狀，說明慢性嗎啡依賴和急性催促戒斷模型建立成功。慢性嗎啡處理后額葉皮質、海馬和紋狀體神經細胞內［Ca2+］i與對照組比較明顯升高(P＜0.01);納洛酮催促戒斷后，大鼠額葉皮質、海馬和紋狀體神經細胞內［Ca2+］i與嗎啡依賴組比較均明顯降低(P＜0.01);CCK-8及其受體拮抗劑預處理使嗎啡戒斷大鼠海馬和紋狀體神經細胞內［Ca2+］i明顯升高(P＜0.05)，而CCK-8及其受體拮抗劑預處理對嗎啡戒斷大鼠額葉皮質神經細胞內［Ca2+］i無明顯影響(P＞0.05);溶劑對照組皮質、海馬和紋狀體內［Ca2+］i與戒斷組相比差異無顯著性(P＞0.05)。見Fig 1，Tab 1。

Fig 1 Effect of CCK-8 and its receptor antagonist on intracellular calcium in prefrontal cortex(PFC)，hippocampus(Hip)and cauduate putamen(CPu)of morphine withdrawal rats(±s，n=6)

Tab 1 Effect of CCK-8 and its receptor antagonists on intracellular calcium in cortex，hippocampus and caudate putamen of morphine withdrawal rats(±s，n=6)

Tab 1 Effect of CCK-8 and its receptor antagonists on intracellular calcium in cortex，hippocampus and caudate putamen of morphine withdrawal rats(±s，n=6)

＊＊P ＜0.01 vs control group;##P ＜0.01 vs Mor;△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs Nal.

Group ［Ca2+］i /%of control PFC Hip CPu Control 1±0 1±0 1±0 Mor 1.282 ±0.109＊＊ 1.704 ±0.101＊＊ 1.697 ±0.171＊＊Nal 1.103 ±0.120## 1.187 ±0.081## 1.293 ±0.045##Vehicle 1.053 ±0.071 1.232 ±0.099 1.327 ±0.086 CCK-8 1.008 ±0.098 1.139 ±0.031△△ 1.441 ±0.017△L-364，718 1.068 ±0.179 1.286 ±0.136△△ 1.447 ±0.013△LY-288，513 1.090 ±0.149 1.474 ±0.189△△ 1.564 ±0.033△△

2.2 CCK-8及其受體拮抗劑對神經細胞內 CaM活性的影響 慢性嗎啡處理使大鼠額葉皮質、海馬和紋狀體神經細胞內 CaM活性明顯增強(P＜0.01);而嗎啡戒斷組大鼠皮質、海馬和紋狀體神經細胞內CaM活性與嗎啡依賴組比較均明顯降低(P＜0.01);CCK-8及其受體拮抗劑預處理使嗎啡戒斷大鼠海馬和紋狀體神經細胞內CaM活性明顯升高(P＜0.05)，而CCK-8及其受體拮抗劑預處理對嗎啡戒斷大鼠皮質神經細胞內CaM活性無明顯影響(P＞0.05);溶劑對照組皮質、海馬和紋狀體內CaM活性與戒斷組相比差異無顯著性(P＞0.05)。見 Fig 2，Tab 2。

Fig 2 Effect of CCK-8 and its receptor antagonists on intracellular calmodulin in cortex，hippocampus and caudate putamen of morphine withdrawal rats(±s，n=6)

Tab 2 Effect of CCK-8 and its receptor antagonist on intracellular calmodulin in cortex，hippocampus and caudate putamen of morphine withdrawal rats(±s，n=6)

Tab 2 Effect of CCK-8 and its receptor antagonist on intracellular calmodulin in cortex，hippocampus and caudate putamen of morphine withdrawal rats(±s，n=6)

＊＊P ＜0.01 vs control group;##P ＜0.01 vs Mor;△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs Nal.

Group CaM/%of control PFC Hip CPu Control 1±0 1±0 1±0 Mor 1.923 ±0.302＊＊ 1.544 ±0.092＊＊ 1.349 ±0.107＊＊Nal 1.153 ±0.051## 0.696 ±0.008## 0.861 ±0.097##Vehicle 1.027 ±0.004 0.632 ±0.029 0.850 ±0.182 CCK-8 1.639 ±0.117△△ 0.887 ±0.044△△ 2.332 ±0.181△△L-364，718 1.393 ±0.031△ 1.043 ±0.114△△ 1.079 ±0.085△△LY-288，513 2.036 ±0.069△△ 1.323 ±0.082△△ 1.594 ±0.189△△

3 討論

阿片成癮是一種慢性復發性腦病，其發生的確切機制尚不清楚。最近研究認為，許多非阿片受體作用系統可能是阿片依賴防治中的重要靶點。膽囊收縮素(cholecystokinin，CCK)是一種典型的腦腸肽，并作為神經遞質和神經調質在中樞神經系統發揮著重要作用［3－4］。研究發現，在中樞神經系統內源性阿片肽、CCK及其受體重疊分布。CCK-8是目前已知作用最強的內源性“抗阿片肽”，其通過CCK1及CCK2兩種不同的受體亞型在疼痛、學習記憶、藥物成癮及情感等方面發揮多重調節作用。以往的研究已證實了CCK在嗎啡依賴和戒斷中的抗阿片作用［5］，并且發現應用CCK受體拮抗劑能逆轉嗎啡耐受、減輕嗎啡成癮大鼠的急性催促戒斷癥狀［6］。但是，我們的研究結果還發現慢性嗎啡作用后中樞CCK受體系統明顯上調［7］，內源性小劑量CCK-8可通過CCK2受體作為一種內源性“抗阿片肽”通過負反饋機制調節嗎啡依賴過程;而外源性大劑量CCK-8則可通過激活CCK1受體抑制嗎啡精神依賴及復吸過程［8］，抑制嗎啡條件性位置厭惡［9］，使內源性阿片肽原PENK、POMC基因表達增加［10］。比較發現，外源性CCK-8的干預劑量要比內源性CCK的劑量高10～1 000倍，我們推斷這種現象與CCK-8的效應濃度存在一定關系，但其具體機制尚不明確。

Ca2+-CaM-CaMK是嗎啡依賴和戒斷過程中一條重要的信號轉導通路。Ca2+是細胞內普遍存在的第二信使，與效應器蛋白的結合，操縱不同生理學反應指令的發出，細胞內鈣離子在調節細胞功能的不同方面起樞軸作用。研究表明嗎啡可通過與其受體結合而改變NG108-15、SH-SY5Y和星形膠質細胞等神經細胞內的 ［Ca2+］i動態平衡［11］。長期應用嗎啡將改變中樞和外周鈣離子通道的數目和開放狀態。使用阿片類細胞內鈣離子濃度的增加可能有兩條途徑:胞外鈣離子內流和細胞內鈣庫釋放鈣離子。王林等［12］采用激光共聚焦顯微鏡觀察發現嗎啡成癮大鼠相關核團神經細胞內［Ca2+］i明顯升高。鈣調蛋白(calmodulin，CaM)是胞內一個重要的信號轉導分子，在一定量的［Ca2+］i存在的情況下，CaM從胞質的游離狀態轉至結合狀態而呈出活性。本實驗顯示，嗎啡依賴大鼠皮質、海馬和紋狀體神經細胞內［Ca2+］i和 CaM的活性明顯增加;而納洛酮催促戒斷則使Ca2+和CaM活性明顯下降，其結果與文獻報道結果一致。溶劑組大鼠皮質、紋狀體和海馬神經細胞內［Ca2+］i和 CaM活性變化同戒斷組相比無明顯變化，這說明每日給予溶劑對神經細胞內的鈣離子濃度變化無影響，從而排除了拮抗劑處理組神經細胞內引起［Ca2+］i和 CaM 活性變化由溶劑引起的可能。

CCK-8干預可以翻轉納洛酮戒斷引起的海馬和紋狀體內［Ca2+］i和 CaM活性的降低，但對皮質內［Ca2+］i和CaM活性的降低無明顯影響。該結果表明，［Ca2+］i和CaM 活性的變化在嗎啡依賴和戒斷過程中起著重要的作用，CCK-8可以通過增加腦內［Ca2+］i和CaM的活性等作用達到緩解部分戒斷癥狀的作用。其機制可能是(1)CCK-8通過激活胞內第二信使 IP3而引起細胞內鈣庫釋放，從而使［Ca2+］i的增加。(2)CCK-8也可能是通過激活DAG-PKC途徑，加速細胞外鈣的內流，從而使［Ca2+］i增加。不同腦區在嗎啡成癮過程中的作用不同，CCK-8其在不同部位可能發揮不同的作用，從而表現出CCK-8作用的腦區特異性。我們在前期研究中發現不同濃度的CCK-8可分別通過激活CCK1/2受體在嗎啡依賴過程中發揮不同作用。由于細胞表面兩種受體亞型(CCK1R和CCK2R)的敏感度及其偶聯Gs/i蛋白的功能不一致，并且 CCK2受體還可能通過Gs或Gi蛋白以及不同的信號通路介導多種生物學功能?？偨Y本文的實驗結果，CCK及其受體拮抗劑翻轉納洛酮催促戒斷引起［Ca2+］i和CaM活性的降低，可能是其對抗嗎啡成癮的機制之一。不同劑量的CCK-8對嗎啡成癮動物的影響及其受體及受體后信號機制還有待進一步研究。

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