靜電場(chǎng)協(xié)同超聲提取甘草中甘草酸的研究*

楊日福閔志玲陳維楚丘泰球

(1 華南理工大學(xué) 理學(xué)院 廣州 510640)

(2 華南理工大學(xué) 輕工與食品學(xué)院 廣州 510640)

1 引言

甘草具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩解止痛和調(diào)和諸藥的功能，是常用中藥材，被中醫(yī)界奉為“藥中之王”。甘草酸是甘草中的制藥活性成分，近代眾多臨床醫(yī)學(xué)研究表明，甘草酸可以有效抑制乙肝病毒(HBV)和感染細(xì)胞表面抗原(HbsAG)的分泌，并且可以明顯地抑制HIV增殖，增強(qiáng)機(jī)體的免疫力[1]。甘草酸也是一種天然的甜味劑，其甜度為蔗糖的200～300倍，可廣泛用于食品，飲料，醫(yī)藥等行業(yè)[2]。

目前甘草酸主要采用提取方法有水提法、稀氨水提取法及氨性醇提取法等[3]。雖然具有不需特殊設(shè)備，成本低等優(yōu)點(diǎn)，但存在提取效率低，提取時(shí)間長(zhǎng)，所得甘草酸純度低等問(wèn)題，對(duì)甘草資源的利用不充分，影響了我國(guó)傳統(tǒng)中藥甘草產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

超聲波能夠破壞藥材細(xì)胞壁，使有效物質(zhì)容易從藥材中提取出來(lái);與傳統(tǒng)方法相比，具有提取率高、提取時(shí)間短、提取全過(guò)程無(wú)需高溫、節(jié)能環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)。因此，超聲提取技術(shù)已經(jīng)作為中藥提取的新方法、新手段被廣泛應(yīng)用[4－6]，但國(guó)內(nèi)現(xiàn)有的超聲提取裝置中，功率和強(qiáng)度受超聲探頭的數(shù)量所制約，難以達(dá)到理想的提取效果。為了解決這些問(wèn)題，近年來(lái)人們把目光投向幾種工藝相互耦合技術(shù)上，例如:將超聲與微波耦合提取[7]，超聲與亞臨界水耦合提取[8]等。將靜電場(chǎng)引入?yún)f(xié)同超聲提取，是功率超聲的一個(gè)新興應(yīng)用領(lǐng)域，由于水分子是一種強(qiáng)極性分子，它的正負(fù)電中心不重合，存在分子電偶極矩，通過(guò)外加直流電場(chǎng)對(duì)水結(jié)構(gòu)的影響，使水分子的排列更為有序，目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于超聲－靜電場(chǎng)協(xié)同處理取得了一定的進(jìn)展:超聲波和電場(chǎng)共同作用，加劇了液體中物質(zhì)的擴(kuò)散和溶解過(guò)程[9]。超聲清洗過(guò)程中加入電場(chǎng)強(qiáng)化時(shí)，促進(jìn)表面清洗效果[10－11]。超聲波協(xié)同電催化提高有機(jī)物的降解效率[12]。但國(guó)內(nèi)關(guān)于超聲－靜電場(chǎng)耦合技術(shù)還處于探索階段，目前關(guān)于超聲－靜電場(chǎng)耦合提取植物有效成分應(yīng)用研究較少。

本文將超聲單獨(dú)作用及超聲和靜電場(chǎng)協(xié)同作用下甘草酸的提取率進(jìn)行比較，通過(guò)曲面響應(yīng)法獲取甘草酸的最佳工藝條件，并驗(yàn)證超聲和靜電場(chǎng)交互作用的存在。

2 材料與方法

2.1 材料與儀器

烏拉爾甘草，購(gòu)于廣州清平藥材市場(chǎng)，干燥粉碎過(guò)60目篩;提取劑為水與乙醇混合溶液(1∶1);水為去離子水(美國(guó)Millipores純水系統(tǒng)處理)，無(wú)水乙醇(分析純，廣州市東紅化工廠)，甘草純品，購(gòu)自陜西慧科植物開(kāi)發(fā)有限公司，純度98%。

UV－5200紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司;KQ－100VDE三頻數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;TDL－50B臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠;101電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司;EST804A高精密雙極性靜電發(fā)生器，北京華晶匯科技有限公司。

靜電場(chǎng)協(xié)同超聲提取裝置示意圖如圖1所示。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 甘草酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制備與提取率計(jì)算

準(zhǔn)確稱取甘草酸純品0.25 g，溶于50 mL體積分?jǐn)?shù)為 50% 的乙醇溶液中;取 1，2，3，4，5 mL，用50%乙醇溶液稀釋至250 mL，以50%的乙醇溶液作參比，在紫外波長(zhǎng)254 nm處測(cè)其吸光度，得標(biāo)準(zhǔn)曲線為 C=(A－0.0076)/12.18746，相關(guān)系數(shù) R2=0.9996;其中 C為甘草酸濃度值(μg/mL)，A 為其對(duì)應(yīng)的吸光度。

在一定工藝條件下實(shí)驗(yàn)所得提取液經(jīng)離心，過(guò)濾，用50%乙醇補(bǔ)充損失的體積，從濾液中取1 mL溶液加到100 mL容量瓶中，用50%乙醇溶液進(jìn)行定容，在紫外波長(zhǎng)254 nm處測(cè)定其吸光度，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可計(jì)算提取液濃度C，甘草酸提取率計(jì)算如下:

式中:C為標(biāo)準(zhǔn)曲線所得濃度值(μg/mL)，V為提取溶劑體積(mL)，M為甘草粉末質(zhì)量(g)。

2.2.2 單因素對(duì)甘草酸提取率的影響

其它因素保持不變，分別考察浸泡時(shí)間、液固比、超聲電功率、提取時(shí)間、超聲頻率、靜電場(chǎng)電壓等單因素對(duì)甘草酸提取率的影響。

2.2.3 響應(yīng)曲面法優(yōu)化甘草酸的提取工藝條件

用4因素3水平的Box－Behnken中心組合設(shè)計(jì)來(lái)確定最優(yōu)的過(guò)程參數(shù)組合，這些因素包括液固比，提取時(shí)間，超聲電功率和靜電壓，通過(guò)實(shí)驗(yàn)建立了超聲提取工藝參數(shù)與甘草酸提取率之間的數(shù)學(xué)模型，獲得最優(yōu)的工藝參數(shù)。

用于預(yù)測(cè)最優(yōu)條件的二次多項(xiàng)式模型的一般表達(dá)式如下:

其中，Y 是甘草酸提取率，β0，βj，βjj和 βij是模型的回歸系數(shù)，Xi和 Xj是影響因素，而 ε是隨機(jī)誤差。

3 結(jié)果與討論

3.1 浸泡時(shí)間對(duì)甘草酸提取率的影響

稱5 g甘草粉末，加入100 mL體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液，超聲頻率為20 kHz，超聲設(shè)備的輸出電功率為100 W，提取時(shí)間30 min，分別考察無(wú)靜電場(chǎng)和10 kV靜電場(chǎng)正交作用，浸泡時(shí)間對(duì)甘草酸提取率的影響。結(jié)果如圖2所示，結(jié)果表明隨著浸泡時(shí)間增長(zhǎng)，甘草酸提取率呈上升趨勢(shì)，但是上升比較緩慢，且最終趨于平緩。說(shuō)明浸泡時(shí)間可以提高甘草酸的提取率，但效果不是很明顯。因此，為了縮短工時(shí)，減小能耗，下述實(shí)驗(yàn)不采取浸泡方法。

圖2 浸泡時(shí)間對(duì)甘草酸提取率的影響Fig.2 Effect of immersed time on extraction yield of glycyrrhizic acid

3.2 液固比對(duì)甘草酸提取率的影響

其他條件同 3.1，溶劑用量分別為 50 mL、75 mL、100 mL、125 mL、150 mL，考察液固比對(duì)甘草酸提取率的影響。結(jié)果如圖3所示，結(jié)果表明甘草酸提取率隨著溶劑用量的增加而增加。這是由于溶劑量大，溶劑中的有效成分濃度低，物料及溶劑邊界層的有效成分濃度差大，因而提取率較高;反之，溶劑中有效成分濃度高，擴(kuò)散推動(dòng)力小，不利于擴(kuò)散，有效成分提取率低。圖中曲線趨勢(shì)可知溶劑用量為50 mL～100 mL時(shí)，提取率上升較快，在100 mL～150 mL時(shí)，趨于平緩，考慮液固比太大對(duì)后續(xù)分離處理帶來(lái)不便，因此液固比采用傳統(tǒng)提取較為常見(jiàn)的20 mL/g(溶劑用量100 mL).

圖3 液固比對(duì)甘草酸提取率的影響Fig.3 Effect of liquid－solid ratio on extraction yield of glycyrrhizic acid

3.3 超聲電功率對(duì)甘草酸提取率的影響

其他條件同3.1，超聲電功率從40 W到100W間隔10W遞增，分別考察超聲電功率對(duì)甘草酸提取率的影響。結(jié)果如圖4所示，結(jié)果表明超聲波提取作用主要取決于超聲波的功率，隨著輸入功率的增加，氣泡逐漸增多，氣泡的最大半徑和膨脹壓縮比增大，空化強(qiáng)度增強(qiáng)，從而有利于甘草中甘草酸提取率的提高。

但當(dāng)超聲功率達(dá)到一定閾值時(shí)，由于聲源附近聚集大量氣泡，形成空化屏蔽，聲能被局限在聲源表面不能傳出去，空化強(qiáng)度不能進(jìn)一步增加，因此提取率達(dá)到飽和不能繼續(xù)增加;此外，大量空化泡將反射聲波而減少了能量的傳遞，因此超聲功率也不能無(wú)限制地提高。

圖4 超聲電功率對(duì)甘草酸提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on extraction yield of glycyrrhizic acid

3.4 提取時(shí)間對(duì)甘草酸提取率的影響

其他條件同3.1，作用時(shí)間從10 min到60 min間隔10 min遞增，分別考察作用時(shí)間對(duì)甘草酸提取率的影響。結(jié)果如圖5所示，結(jié)果表明當(dāng)提取時(shí)間從10 min增加到20 min時(shí)，提取率上升比較快，在20 min到30 min，提取率進(jìn)一步上升，但上升速度明顯減慢，而在30 min后提取率反而有下降。

圖5 提取時(shí)間對(duì)甘草酸提取率的影響Fig.5 Effect of extraction time on extraction yield of glycyrrhizic acid

超聲提取的主要推動(dòng)力是有效成分濃度差，在提取初期，有效成分濃度差大，因此提取速率快，提取率增加明顯，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，溶劑中有效成分濃度逐漸增大，和固相中的濃度差逐漸變小，推動(dòng)力也變小，也就是提取液中甘草酸濃度已基本與甘草中甘草酸濃度達(dá)到平衡，所以提取速率慢慢減緩。同時(shí)，由于超聲波長(zhǎng)時(shí)間作用，更多雜質(zhì)溶出，提取液經(jīng)離心，過(guò)濾后，雜質(zhì)的沉降帶走部分甘草酸，導(dǎo)致溶液中甘草酸濃度將下降的結(jié)果。

3.5 超聲頻率對(duì)甘草酸提取率的影響

其他條件同 3.1，超聲頻率分別為 20 kHz、40 kHz、80 kHz、100 kHz時(shí)，考察超聲頻率對(duì)甘草酸提取率的影響。結(jié)果如圖6所示，結(jié)果表明超聲頻率越低，提取率越高。這是因?yàn)槌暱栈F(xiàn)象能否發(fā)生與超聲頻率有直接的關(guān)系，頻率越高產(chǎn)生空化的聲壓空化閾值越高，越難以發(fā)生空化。另一方面，在相同功率時(shí)，頻率越低空化效應(yīng)中的機(jī)械作用越強(qiáng)，頻率越高，化學(xué)效應(yīng)越明顯，而超聲波提取作用是空化作用破壞細(xì)胞壁，因此機(jī)械作用越強(qiáng)的低頻空化效果更明顯。

圖6 超聲頻率對(duì)甘草酸提取率的影響Fig.6 Effect of ultrasonic frequency on extraction yield of glycyrrhizic acid

3.6 靜電壓對(duì)甘草酸提取率的影響

其他條件同 3.1，靜電場(chǎng)電壓分別 5 kV、7.5 kV、10 kV、12.5 kV、15 kV 時(shí)，考察靜電場(chǎng)電壓對(duì)甘草酸提取率的影響。結(jié)果如圖7所示，結(jié)果表明靜電壓為10 kV前隨著電壓增加甘草酸提取率逐漸增加，但當(dāng)電壓超過(guò)一定臨界閾值時(shí)，甘草酸提取率反而迅速下降，當(dāng)靜電壓超過(guò)一定范圍時(shí)，反而會(huì)對(duì)超聲提取起到抑制作用。

在超聲場(chǎng)中加入靜電場(chǎng)，相對(duì)單獨(dú)超聲作用時(shí)提取率提升，說(shuō)明靜電場(chǎng)對(duì)超聲場(chǎng)有促進(jìn)作用，借鑒文獻(xiàn)推測(cè)主要原因:(1)由于靜電場(chǎng)的存在，對(duì)溶液產(chǎn)生微干擾，溶液中大直徑氣泡增多，增加了空化效應(yīng)[13];(2)靜電場(chǎng)作用使空化氣泡產(chǎn)生形變，沿場(chǎng)強(qiáng)方向拉伸拉長(zhǎng)，使空化泡變成橢圓形，使處于穩(wěn)態(tài)空化核中一部分轉(zhuǎn)化為瞬態(tài)空化，增加了空化效應(yīng)的聲化學(xué)產(chǎn)額[14－15]，從而提高了甘草酸的提取率。但是，根據(jù)文獻(xiàn)[14]的研究可知，氣泡的長(zhǎng)徑隨電場(chǎng)升高而增大，短徑隨電場(chǎng)升高而減少，氣泡的長(zhǎng)徑與短徑之比同Weber數(shù)(定義為εE2r/σ，其中r為氣泡的未變形的半徑)相關(guān)聯(lián)，勢(shì)必導(dǎo)致空化泡的自然共振頻率的改變，只有當(dāng)空化泡的自然共振頻率與使用超聲的頻率相近時(shí)，才能達(dá)到有效的能量耦合，對(duì)于一定的超聲頻率和聲強(qiáng)，必定有一個(gè)最大效果的靜電場(chǎng)電壓與之對(duì)應(yīng)。

圖7 靜電場(chǎng)對(duì)甘草酸提取率的影響Fig.7 Effect of electrostatic field on extraction yield of glycyrrhizic acid

3.7 采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化提取工藝

3.7.1 分析因素的因素與水平選取

根據(jù)單因素影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取液固比，提取時(shí)間，超聲電功率和靜電壓4個(gè)影響因素，采用3水平的Box－Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)行曲面響應(yīng)分析優(yōu)化，試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 甘草酸提取試驗(yàn)的因素與水平Table 1 Factors and levels in extraction experiments of glycyrrhizic acid

3.7.2 模型的建立及其顯著性檢驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，共29個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，其中1～24為析因?qū)嶒?yàn)，25～29為中心實(shí)驗(yàn)。29個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)分為析因點(diǎn)和零點(diǎn)，其中析因點(diǎn)是由因素 X1，X2，X3，X4所構(gòu)成的多維空間頂點(diǎn)，零點(diǎn)為區(qū)域的中心，零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行5次，用以估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差[16]。

表2 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Table 2 Response surface experimental design and results

利用Design－Expert軟件對(duì)表2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合[16]，得到甘草酸提取率對(duì)液固比(X1)，提取時(shí)間(X2)，超聲電功率(X3)和靜電壓(X4)的二次多項(xiàng)回歸模型如下:

對(duì)該模型進(jìn)行方差分析和回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 甘草酸提取的二次多項(xiàng)式模型的方差分析Table 3 Analyses of variance for quadratic polynom ialm odel of glycyrrhizic acid extraction

由表3可得，液固比和超聲電功率對(duì)提取率有極顯著的作用，其次為提取時(shí)間和靜電壓。X3X4項(xiàng)的p值為0.0493，表明超聲及靜電場(chǎng)之間的交互作用很顯著。另外，模型的p值＜0.0001，表明該數(shù)學(xué)模型能提供可靠的預(yù)測(cè)結(jié)果及能充分地代表過(guò)程變量和響應(yīng)因素之間的真實(shí)關(guān)系。

3.7.3 過(guò)程優(yōu)化

通過(guò)Design－Expert軟件確立各因素的最佳提取條件的編碼值為:X1=0.999957，X2=－ 0.107502，X3=0.999995，X4=－ 0.198262。變換成真實(shí)值可得:液固比為30 mL/g，提取時(shí)間為28.92 min，超聲電功率為100 W，靜電壓為9.01 kV，在此條件下，甘草酸提取率理論值可達(dá)到11.08%。

為驗(yàn)證響應(yīng)曲面法所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化條件進(jìn)行甘草酸的提取，考慮到施加操作的便利，將提取工藝參數(shù)修正為:液固比為30 mL/g，提取時(shí)間為29 min，超聲電功率為100W，靜電壓為9 kV，在此條件下提取5次，實(shí)際測(cè)得的平均提取率為11.02%，與理論預(yù)測(cè)值相比，其相對(duì)誤差約為0.53%。因此，基于響應(yīng)曲面法所得的優(yōu)化提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，其甘草酸提取工藝條件對(duì)甘草的綜合利用以及甘草酸產(chǎn)業(yè)化具有理論指導(dǎo)意義。

4 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)結(jié)果，加入靜電場(chǎng)，可強(qiáng)化超聲提取甘草酸效率。運(yùn)用曲面響應(yīng)法分析也表明了超聲與靜電場(chǎng)存在交互作用。影響因素對(duì)甘草酸提取率影響的大小次序?yàn)?(液固比)＞(超聲電功率)＞(提取時(shí)間)＞(靜電壓)。得出甘草中甘草酸的最優(yōu)條件為:液固比為30 mL/g，提取時(shí)間為29 min，超聲電功率為100 W，靜電壓為9 kV;在該條件下甘草酸的提取率為11.02%。綜上所述，利用超聲與靜電場(chǎng)耦合提高甘草酸得率的方法在工業(yè)化應(yīng)用上具有發(fā)展?jié)摿Γ牵o電場(chǎng)與超聲場(chǎng)正交作用從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看不是十分明顯，根據(jù)Sobotka等[17]進(jìn)行直流電場(chǎng)對(duì)超聲信號(hào)的振幅影響研究表明:超聲－靜電場(chǎng)正交耦合不及平行耦合效果顯著，平行耦合效果有待今后進(jìn)一步探索。

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